关键词：
NS
p53缺失型HL-60白血病细胞
自噬
基因敲低
摘要：
目的:本研究采用CRISPR/Cas9技术构建靶向敲低nucleostemin（NS,又称GNL3）基因的p53缺失型HL-60急性髓系白血病细胞系,研究敲低NS表达对HL-60细胞增殖、凋亡、细胞周期及自噬活性的影响,进一步探究课题组之前研究的NS非p53信号通路可能影响细胞的自噬活性,阐明其生物学意义。通过应用自噬诱导剂雷帕霉素（rapamycin,RAPA）和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）,分析自噬活性的变化对NS敲低相关的HL-60细胞生物学特性的影响,为研究基于抑制NS信号通路及调节细胞自噬作用的急性髓系白血病靶向治疗策略奠定基础。方法:（1）培养人急性髓系白血病细胞系HL-60,以HL-60细胞基因组为模板,对NS基因进行PCR扩增,扩增产物做Sanger测序,将Sanger测序结果与NCBI序列进行比对。（2）设计靶向小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）,通过体外及细胞内筛选,选取编辑效率最高的sgRNA,其对应的细胞群,进行单克隆细胞株筛选。收集存活的单克隆细胞株进行Sanger测序,观察NS基因敲除情况。（3）通过qRT-PCR、western blot检测敲低前后HL-60细胞内NS基因在mRNA水平和蛋白水平的变化情况。（4）利用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法和流式细胞术,检测敲低NS后HL-60细胞增殖、凋亡及周期的变化。通过Western blot检测敲低NS后细胞内微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated light chain protein 1 light chain 3,LC3）蛋白、P62蛋白的表达情况来观察细胞自噬活性的改变。（5）采用不同浓度的RAPA和3-MA处理HL-60细胞24h,用MTT法测定敲低NS联合应用自噬调节剂对HL-60细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率的变化。（6）Image J图像处理软件对目的蛋白条带进行灰度分析及计算。运用SPSS22.0统计学分析软件处理数据,数据以均数±标准差（x±s）表示。多组独立样本间的比较采用单因素方差分析,进一步两两间的比较采用Bonferroni法,校正检验水平α′=0.0167;两组独立样本间比较采用t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。结果:（1）Sanger测序结果显示HL-60细胞的NS基因序列与NCBI中NS的基因序列一致。（2）确定sgRNA 3-5的基因编辑能力优于其它sgRNA,对获得的单克隆细胞株进行测序鉴定,均未获得完全敲除NS基因的单克隆细胞株;选取两株杂合突变株进行后续实验,qRT-PCR和werstern blot检测结果显示:两株杂合突变的HL-60细胞中NS在mRNA水平及蛋白水平的表达量均出现了明显下调,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）MTT检测结果显示,与对照组HL-60细胞相比,NS敲低组细胞的增殖能力明显下降。采用流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,结果显示:与对照组相比,NS敲低组细胞凋亡率增高;NS敲低组G1期细胞百分比增高,S期细胞百分比降低,差异均具有统计学意义（P<0.05）。（4）Werstern blot结果显示,与对照组相比,NS敲低组HL-60细胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增高（P<0.05）,P62蛋白相对表达量降低（P<0.05）。（5）不同浓度的RAPA处理HL-60细胞24h后,MTT法显示各组细胞的增殖均受到抑制,且具有剂量依赖效应;流式细胞术检测细胞凋亡显示随着RAPA浓度的升高,细胞凋亡率逐渐增高（P<0.05）。（6）不同浓度的3-MA处理HL-60细胞24h后,MTT法显示在一定浓度范围内,各组细胞的增殖均受到抑制,且具有剂量依赖效应;流式细胞术检测细胞凋亡显示在所测浓度范围内,细胞凋亡率无明显变化（P>0.05）。结论:（1）NS在人急性髓系白血病HL-60细胞中的表达下调,可在一定程度上抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,使细胞周期发生G0/G1期阻滞,并可增强细胞的自噬活性,提示NS可能是急性髓系白血病治疗的潜在靶点。（2）RAPA激活的自噬对HL-60细胞的生长增殖具有抑制作用,可诱导细胞发生自噬性死亡,并能显著增强NS下调对细胞增殖及凋亡的作用。3-MA通过抑制自噬在一定程度上使HL-60细胞的生长增殖受抑,但对细胞凋亡无明显影响。
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