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关键词： 细胞命运   中枢神经系统   心脏发育   小胶质细胞   器官发育   肝脏发育   类器官   发育生物学   分子调控机制   细胞生物学   作用机理  

摘要： 器官正常发育是器官行使正常生理功能的基础,组织器官发育异常会导致出生缺陷、器质性疾病甚至胚胎期死亡,心脑血管疾病、代谢性疾病、免疫相关疾病等与器官发育异常也有密切关系。因此,深入研究和解析器官发育的细胞和分子基础意义重大,是生命科学的研究热点,对于保障人类健康具有重要意义。

关键词： 毛囊重建   毛乳头细胞   外泌体   诱导活性  

摘要： 背景和目的近年来人们的脱发发病率逐渐增长,严重影响患者的身心健康。治疗脱发方法包括自体毛囊移植术、口服非那雄胺、外用米诺地尔等,但存在副作用、停药后脱发进程会继续,因此探索新的有效的方法有必要。关于其实验研究包括组织工程毛囊重建、毛囊细胞克隆、毛囊细胞移植疗法等,其中得益于组织工程研究发展迅猛,毛囊重建在治疗脱发的研究中较有前景。毛囊的重建需要大量及具有生物学活性的种子细胞,包含有毛囊干细胞(hair follicle stem cells,HFSC)及毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPC)。毛囊是皮肤附属器的器官,由真皮组分和表皮组分组成。DPC聚集在毛乳头(DP)内,DP在毛球部被毛母质细胞等包绕。HFSC与DPC相互作用形成新的毛囊,DPC被认为是毛囊形态发生和周期性生长必需的。但DPC在体外经过多次扩增培养,它的生物学活性逐渐消失,因此,改善或维持DPC在体外培育扩增后的诱导活性,是组织工程毛囊重建中重要一步。外泌体,为来源细胞通过旁分泌细胞外排形成的囊泡,直径约为30-150nm,其内携带有来源细胞的DNA、RNA、多种蛋白质等物质,可存在于细胞培养上清液、血液等。因此我们在本实验中通过使用低代数DPC来源的外泌体培养高代数DPC,尝试以其改善DPC的生物学活性,为毛囊重建提供有效的种子细胞,为脱发治疗提供新的研究思路。方法:1.鼠触须垫DPC的分离培养及外泌体的提取与鉴定通过显微解剖+酶消化法获取小鼠触须垫的DP,观察其形态、贴壁和迁出情况,并对细胞进行传代培养扩增。收集低代数DPC的培养上清液并通过超速离心法提取外泌体,并采用粒径检测、电镜观察和外泌体表面标志蛋白检测鉴定。2.外泌体培养DPC对其生物学活性的检测通过添加外泌体培养第3代(P3)和第8代(P8)的DPC,并通过CCK8、qRT-PCR、WB检测其生物学活性。3.经外泌体培养的DPC诱导毛囊再生的研究使用外泌体培养后的DPC及新生鼠的上皮细胞通过注射法进行毛囊重建,通过体视镜、组织切片H&E染色观察情况。结果:1.通过显微解剖+酶消化法能获取小鼠触须垫的DP,细胞正常迁出,扩增培养后DPC呈聚集性生长,但随着传代次数的增加,DPC逐渐失去聚集性生长的特性,且细胞增殖能力减弱。通过超速离心法能提取出直径30-150nm、表达特异性标志蛋白的外泌体。2.添加外泌体培养不同代数的DPC结果显示P3、P8实验组细胞增殖能量较对照组高,P3、P8实验组细胞的相对特异性标记物也较对照组的表达水平高。3.使用外泌体培养的P3和P8的DPC用于毛囊重建,可见P3实验组及对照组均能诱导毛囊再生,而P8组仅实验组能诱导毛囊重建,且再生毛囊数量少。结论:1.通过显微解剖+酶消化法可获取小鼠触须垫的DP,并未影响细胞迁出及DPC的形态、生长特性和增殖活性。通过粒径检测、电镜观察和外泌体表面标志蛋白检测鉴定使用超速离心法可提取出较纯丰富的外泌体。2.添加外泌体培养不同代数的DPC,可部分改善DPC的生物学活性。3.使用外泌体培养的高代数DPC仍能诱导毛囊再生。

关键词： 《中国细胞生物学学报》   细胞生物学  

摘要： 《中国细胞生物学学报》(原《细胞生物学杂志》)创刊于1979年9月,目前由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所和中国细胞生物学学会共同主办,是国内外公开发行的专业性学术期刊。在过去四十年里,作为我国细胞生物学最权威的中文期刊,《中国细胞生物学学报》秉承推动我国细胞生物学发展的宗

关键词： 肝细胞癌   微小染色体维持蛋白7   细胞增殖   细胞迁移   细胞凋亡  

摘要： 肝癌是影响人类健康的重要疾病之一,全球每年新发病数超过850,000例。而在所有原发性肝癌中,肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是最常见的肿瘤,目前针对HCC并无非常理想的早前诊断和治疗手段。因此,深入了解肝细胞癌发生发展的机制对发现肝癌新型生物学标志物和潜在有效的治疗靶点至关重要。我们课题组致力于HCC肿瘤干细胞起源、维持机制与生物学作用的探索,并在此基础上进行打击HCC肿瘤干细胞和抑制肿瘤转移等策略研究。在前期工作中,我们发现微小染色体维持(Minichromosome maintenance,MCM)蛋白家族中重要的成员之一—MCM7,有可能在HCC的肿瘤干细胞维持及肿瘤转移中发挥作用。该家族目前有十个成员,是DNA复制前复合物的重要组成部分,在DNA复制精确启动和DNA损伤修复中扮演重要角色。我们课题组利用肝癌组织芯片检测其表达情况并分析其临床病理意义,研究结果表明在80对肝癌/癌旁组织标本中,相比于癌旁组织,MCM7在肝癌组织中高表达,并与肝癌临床病理分级、肿瘤大小、AFP水平呈正相关,与肝癌患者生存时间呈负相关。本课题旨在进一步明确MCM7在肝癌发生发展的作用,通过慢病毒转染MCM7干涉载体,构建MCM7敲低的稳转肝癌细胞株,研究MCM7敲低后肝癌细胞生物学功能的变化,利用基因芯片技术,分析MCM7敲低对肿瘤细胞内基因表达的影响,初步探讨其可能的作用机制。研究共分为三个部分:第一部分:低表达MCM7稳转细胞株的建立与鉴定方法:利用网站(***)预测MCM7基因小干涉RNA(siRNA),再按照构建shRNA表达载体的原则,设计MCM7-shRNA基因的正义和反义寡核苷酸序列。之后将干涉片段与pSicoR载体连接,酶切及测序鉴定显示正确后,将该质粒通过慢病毒包装后感染肝癌细胞系(Huh7.5.1、PLC/PRF/5、Hep3B、HCCLM3),扩增后通过无菌流式分选获得表达GFP荧光阳性细胞,收集细胞进行Western印迹检测,鉴定所构建稳转细胞株是否降低MCM7表达水平。结果:通过流式分选后,在荧光显微镜下,我们发现各肝癌细胞系均表达出较强的绿色荧光,表明构建的pSicoR-shMCM7干涉质粒已在细胞中表达。进一步通过Western印迹检测,发现在各肝癌细胞系中MCM7蛋白水平均有明显下调,证明成功构建了稳定低表达MCM7的细胞株。第二部分:敲低MCM7对于肝癌细胞生物学功能的影响方法:绘制肝癌稳转细胞株的生长曲线,并且对肝癌细胞的克隆形成能力进行检测,观察MCM7表达下调后对肝癌细胞增殖能力的影响;此外,通过构建肿瘤细胞的3D培养模型来模拟肿瘤细胞在体内的微环境,进一步探究在三维培养模型中敲低MCM7后对肝癌细胞增殖能力的影响。此外,通过细胞划痕实验以及流式检测凋亡细胞比例,探究MCM7在肿瘤细胞迁移与凋亡中所发挥的作用。进一步选择肝癌细胞系Huh7.5.1和HCCLM3作为研究对象,收集MCM7敲低组及对照组细胞,与基质胶混合后接种在小鼠皮下,通过皮下荷瘤实验观察敲低MCM7后对肝癌细胞体内成瘤能力的影响。每周观察两次,并在第40天处死小鼠,取小鼠皮下肿瘤进行称重和拍照。结果:生长曲线结果表明随着时间推移,MCM7敲低组的细胞增殖能力明显低于对照组,同时MCM7敲低组克隆形成集落数也小于对照组,以上结果表明,敲低MCM7能够抑制肝癌细胞增殖能力。此外在3D培养模型中,我们也证实敲低MCM7对细胞增殖能力具有一定抑制作用。在划痕实验和细胞凋亡比例的检测中,我们发现敲低MCM7抑制细胞迁移能力并促进凋亡。在皮下荷瘤实验中,我们发现敲低MCM7组的成瘤率和成瘤大小明显小于对照组,表明敲低MCM7能抑制肝癌细胞在体内的成瘤能力。第三部分:MCM7靶基因的预测方法:通过对MCM7敲低后的肝癌细胞系进行表达谱基因芯片的检测,利用P值和倍数变化值结合相关文献调研进行差异基因筛选,标准为上调或下调倍数变化值≥1.5且P≤0.05,通过实时定量PCR对miRNA进行初步验证。与此同时,对获得的差异基因进行ceRNA分析,探讨MCM7可能的作用机制。结果:通过筛选,共获得50对ceRNA。对获得的ceRNA进行进一步GO和KEGG分析。GO分析结果显示,敲低MCM7后能够负性调控NF-κB转录因子活性、MAP激酶活性、经典Wnt信号通路、ERK1和ERK2级联反应等,而这些因子在癌症的发生发展中都发挥着重要作用。KEGG分析结果显示,MCM7敲低后信号通路的改变主要涉及细胞代谢、细胞凋亡、干细胞功能等方面。此外PCR结果显示,敲低MCM7后能够上调miRNA-194和下调miRNA-629的表达。全文总结:本研究结果表明MCM7敲低后能够抑制肝癌细胞的增殖、迁移能力,促进细胞

关键词： 食管鳞癌   MCT4   乳酸   细胞生物学  

摘要： 背景在全球范围内,食管癌在常见的癌症中排名第九且癌症死亡率排名第六?在中国大部分患者是食管鳞状细胞癌。常见治疗方式为手术治疗和放化疗?但是这些治疗方式往往未达到患者的预期治疗效果。因此需求一种新的治疗方法,来提高患者的生存率。单羧酸转运蛋白4(Monocarboxylate transporter 4,MCT4)的主要作用是将肿瘤细胞能量代谢过程中有氧糖酵解产生的乳酸转运到细胞外。有很多研究证实,MCT4在口腔鳞癌和结直肠癌等多种肿瘤中有着高表达,且下调其MCT4表达可以减弱肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等。这为临床上治疗恶性肿瘤提供了一个新的思路。通过检索MCT4相关文献,发现MCT4在食管鳞癌中的研究较少。本研究将探讨MCT4在食管鳞癌(组织、细胞)中的表达情况;及其组织表达水平与临床病理参数(淋巴转移、临床分期等)之间的关系;并特异性下调食管鳞癌细胞EC109和EC9706中的MCT4,探讨MCT4对其细胞生物学行为的影响。材料与方法1.材料1.1选取我院病理科2014年11月1日到2015年11月1日食管鳞癌患者的组织病理标本,另取癌旁组织病理标本。根据纳入标准和排除标准筛选后,共选取到食管鳞癌组织标本60例,癌旁组织19例。1.2正常食管上皮细胞Het1-A、食管鳞癌细胞EC109和EC9706均由我院消化研究所捐赠。2.方法2.1应用免疫组化检测MCT4在60例食管鳞癌组织和19例癌旁组织中的表达情况及分析其表达水平和临床病理参数之间的关系。2.2应用Western blot检测食管上皮细胞Het1-A、食管鳞癌细胞EC109和EC9706的MCT4蛋白表达情况。2.3应用siRNA瞬时转染的方法下调高表达MCT4的食管鳞癌EC109和EC9706,采用Western blot检测各组细胞中MCT4蛋白表达情况。2.4采用乳酸测定试剂盒、CCK8试剂盒、划痕和Transwell技术分别检测下调MCT4表达后,各组细胞内外乳酸水平、增殖能力和迁移侵袭能力的变化情况。2.5应用SPSS16.0统计软件进行统计分析,MCT4在食管鳞癌组织中的表达情况和其临床病理参数的比较采用卡方分析或Fisher精确检验分析。细胞实验中各组的比较使用单因素方差分析,检验水准都为α=0.05。结果1.免疫组化结果显示:食管鳞癌组织与癌旁组织相比较,MCT4在食管鳞癌组织中有着更高的表达率(p<0.05),并且与肿瘤的分化程度有关(P<0.05),而与患者的临床分期(P>0.05)和年龄(P>0.05)等因素无关。*** blot检测结果显示:MCT4在食管鳞癌细胞EC109和EC9706中的表达水平高于正常食管上皮细胞Het1-A(p<0.05)。*** blot检测结果显示:通过siRNA瞬时转染以后的食管鳞癌细胞EC109和EC9706中MCT4蛋白表达水平均下降(p<0.05)。4.下调食管鳞癌细胞EC109和EC9706中的MCT4的表达后,两种细胞内的乳酸含量均升高(p<0.05),且两种细胞外的乳酸含量均降低(p<0.05)。5.下调食管鳞癌细胞EC109和EC9706中的MCT4的表达后,两种细胞的增殖能力(p<0.05)、迁移能力(p<0.05)和侵袭能力(p<0.05)均下降。结论***4在食管鳞癌组织中呈高表达,且与病理分化程度有关。***4在食管鳞癌细胞EC109和EC9706中呈高表达,下调其表达,可以减弱食管鳞癌细胞的乳酸转运能力、增殖能力、迁移和侵袭能力。

关键词： 急性髓系白血病   白血病干细胞   白血病相关巨噬细胞   耐药   凋亡  

摘要： 背景和目的:急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是最常见白血病类型,随年龄增长发病率逐渐增高,是中老年人群的主要恶性疾病。其中,40%50%AML患者在治疗过程中疾病出现复发,最终导致死亡,如何提高复发难治AML疗效是临床急需解决的问题。针对AML复发的研究目前主要集中在AML细胞和AML白血病干细胞（leukemic stem cells,LSCs）。事实上,AML LSCs并非孤立存在,其生物学特点与其所在骨髓造血微环境的功能异常息息相关,国内外研究显示白血病异常造血微环境具有维持AML-LSCs干性的作用。我们在前期预实验中发现:在AML患者骨髓活检片中发现大量CD68呈强阳性表达的细胞,这些细胞与白血病细胞混合存在;在正常人骨髓活检中仅能看到少量CD68阳性细胞。CD68是巨噬细胞表面标记,AML患者骨髓活检中大量巨噬细胞源于何处,对白血病发生发展产生什么样的作用,值得进一步探索。近年,实体肿瘤领域研究发现,肿瘤组织中有大量巨噬细胞,这些巨噬细胞被称作肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage,TAMs）,其在促进肿瘤细胞增殖侵袭、新生血管形成以及产生免疫抑制等方面发挥重要作用,成为肿瘤微环境研究的热点问题。虽然TAMs在血液肿瘤领域的研究仍处于起步阶段,但是现有研究已经显示TAMs在血液肿瘤发生发展中的重要作用。巨噬细胞来源于髓系单核细胞,AML患者髓系干细胞恶性变,我们推测AML微环境中大量巨噬细胞可能来源于恶性变的AML LSCs。本研究拟分选AML LSCs,在巨噬细胞条件培养基中培养,获得AML LSCs源性巨噬样细胞,深入探讨AML LSCs源性巨噬样细胞生物学特性,为全面认识AML LSCs源性巨噬样细胞在AML异常微环境形成中的作用提供理论依据,也为难治复发AML新型治疗模式的探索提供可行的设计思路。方法:1.用流式细胞技术分选AML细胞系Kasumi-3和原代AML骨髓标本中CD34+CD38-CD123+AML LSCs,置于含有GM-CSF和IL-4的培养基中培养1周,之后转入含有IL-4、TGF-β的培养基中继续培养,获得AML LSCs源性巨噬样细胞;透射电镜观察AML LSCs源性巨噬样细胞超微结构变化;激光共聚焦显微镜观察AML LSCs源性巨噬样细胞表面标记表达情况;选择有AML1/ETO融合基因AML患者骨髓标本进行分选培养获得AML LSCs源性巨噬样细胞,分别检测AML LSCs、AML LSCs-源性巨噬样细胞AML1/ETO表达情况;***检测AML LSCs源性巨噬样细胞培养上清IL-10和IL-13水平;细菌吞噬试验验证AML LSCs源性巨噬样细胞生物学功能;检测与AML LSCs源性巨噬样细胞共培养后,Kasumi-3细胞表面耐药蛋白ABC表达情况;不同培养条件下测定Kasumi-3细胞对多种化疗药物耐药系数的变化及不同培养条件下Kasumi-3细胞对DNR的摄药量;3.通过调取GEO（Gene Expression Omnibus）、TCGA（The Cancer Genome Atlas）等数据库数据,寻找分析AML LSCs源性巨噬样细胞参与肿瘤发生发展过程中起着重要重用的调控基因群,进一步分析这群基因与AML预后的相关性,从而找出参与AML调控的关键基因,分析这些基因的表达情况及其下游调控网络和信号通路。结果:1.培养获得的AML LSCs源性巨噬样细胞呈多形性,以多角形和椭圆形贴壁细胞为主,透射电镜发现细胞呈椭圆形,胞浆丰富,有较多空泡;近胞核处高尔基体富集;包膜绒毛丰富且较长。细胞特异性表达CD11b、CD163、CD206;以AML1/ETO为标记,证明AML LSCs源性巨噬样细胞与AML LSCs细胞具有同源性,均检测到不同水平AML1/ETO融合基因表达;***检测AML LSCs源性巨噬样细胞培养上清细胞因子水平:IL-10分泌高峰在培养第8天,分泌量为12.2pg/ml,IL-13的分泌高峰在第10天,分泌量为14.1pg/ml;细菌吞噬试验证明其可吞噬大量呈绿色杆状荧光的***菌,随着孵育时间的延长,吞噬数量逐渐增多;3.激光共聚焦显微镜观察发现与AML LSCs源性巨噬样细胞共培养的Kasumi-3细胞表面ABC转运蛋白表达明显强于对照组,对柔红霉素（DNR）摄药量低于悬浮培养Kasumi-3细胞（54.75±4.28 vs.93.84±3.93）(P<0.01),对阿霉素（ADM）、阿糖胞苷（Ara-C）和足叶乙甙（VP-16）均有一定的耐药性。4.通过对GEO数据库检索、GEO2R分析和TCGA数据库的在线分析,得到34个基因与AML预后显著相关基因;通

关键词： SPERT   结直肠癌   基因沉默   细胞增殖   细胞凋亡  

摘要： 目的:结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,且在结直肠癌患者的疾病进展过程中约有35%55%的患者会出现肝肺等远处转移,这些患者生存率明显下降。结直肠癌I期患者的5年生存率高达80-90%,而在晚期结直肠癌患者中则低于10%。手术一直是而且目前仍然是结直肠肿瘤的主要治疗方法,而新辅助放化疗及辅助化疗则是预防术后复发和提高生存率的重要手段。结直肠癌是一种遗传异质性疾病,目前除了对少数几个基因（APC,p53,KRAS）的研究机制较明确外,参与了CRC（colorectal cance,结直肠癌）发病过程的其他大部分基因暂不明确。因此,人们一直在尝试发现新的CRC易感性基因,以用于常规遗传学诊断及临床治疗。SPERT基因（spermatid associated）定位于人染色体13q14.13,是一种蛋白质编码基因,该基因编码产物为SPERT蛋白,属于Chibby蛋白质家族。SPERT蛋白的功能尚不清楚,其在哺乳动物的进化中高度保守,具有它独特的属性,其结构中含有一个亮氨酸拉链结构（leucine zipper,LZIP）和两个卷曲螺旋区域（coiled-coil,CC）,在许多情况下亮氨酸拉链结构参与同源二聚化或寡聚化,它们往往是和癌基因表达调控功能有关,故受到研究者的重视。本课题首先利用生物信息学方法分析了SPERT表达水平与结直肠癌临床资料的相关性,并通过人结直肠癌肿瘤细胞系体外培养干预实验和裸鼠成瘤动物模型实验,采用RNA干扰技术、实时荧光定量PCR、慢病毒载体转染、Western Blot、Celigo细胞计数法、MTT法、流式细胞术、Path Scan信号通路检测、IHC免疫组化、TUNEL法等手段,从分子、细胞以及动物整体水平探讨SPERT这个功能未知的基因对结直肠肿瘤细胞的生物学特性的影响及其可能的作用机制,并进一步从动物模型验证。具体研究内容分为三个部分:（1）基于生物信息学方法筛选出目的基因SPERT,并分析其在结直肠癌中的表达情况及其与临床资料的相关性;（2）探讨RNA干扰技术沉默基因SPERT对大肠癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用的可能机制;（3）探讨SPERT基因沉默对大肠癌细胞在动物体内成瘤的影响。本课题初步探索SPERT在结直肠癌的发生、发展中的潜在作用,并揭示其潜在的发生机制,为临床有效诊治结直肠癌提供新思路、新靶点。方法:第一部分:利用大规模多组学数据,通过TCGA（The Cancer Genome Atlas,癌症和肿瘤基因图谱）数据库中结肠癌（Colon adenocarcinoma,COAD）和直肠癌（Rectum adenocarcinoma,READ）两大类数据,选取RNAseq以及RNAseq V2的成对样本数据进行分析,筛选出差异表达有统计学意义的目的基因,在获取与结直肠癌疾病相关的生物分子信息（即目的基因）后,再进一步利用生物信息学方法分析其在癌组织中的表达水平与大肠癌患者的淋巴结转移、远处转移以及病理分期等临床资料的相关性,并进行统计学分析。第二部分:以目的基因SPERT为模板,设计RNAi靶点序列,构建RNAi慢病毒载体,并转染大肠癌肿瘤细胞。本部分实验中使用q PCR（Quantitate Real-Time PCR,实时荧光定量PCR）的方法检测目的基因在不同结直肠癌细胞中m RNA的表达丰度,采用2-ΔΔCt分析法计算,选用结直肠癌细胞系中目的基因SPERT表达量最突出的细胞系作为实验目的细胞。在慢病毒成功感染目的细胞后,分别应用q PCR的方法检测细胞中目的基因敲减后m RNA的表达量,以及WB（Western Blot,蛋白免疫印迹）的方法检测细胞中目的基因敲减后蛋白的表达量,进而判断靶点的干扰效果。接着,采用Celigo细胞计数法检测记录各时间点的细胞数目,从而分析细胞的生长状况;通过MTT法检测细胞活力来验证目的基因对细胞增殖的影响;Caspase-Glo?3/7 Assay法检测细胞凋亡情况来验证目的基因对细胞凋亡的影响;FACS（Fluorescence Activating Cell Sorter,流式细胞仪）(Annexin V-APC单染法)检测处于凋亡状态的细胞数量来检验目的基因与细胞凋亡的关联,了解该基因沉默后对结直肠肿瘤细胞的增殖、凋亡的影响。第三部分:根据上述的实验结果确定SPERT的功能后,使用Path Scan?Antibody Array Kit检测和比较sh Ctrl对照组与sh SPERT干预组细胞中应激和凋亡信号通路关键信号分子的变化,包括P44/42 MAPK（ERK1/2）,Akt,Bad,HSP27,Smad2、p53、p38 MAPK、SAPK/JNK、PARP、Caspase-3、Caspase-7、IκBα、Chk1、Ch

关键词： 棉花   花芽分化   第一果枝节位   开花时间   生育期   细胞生物学  

摘要： 在有花植物中，植物由无性生长向有性生长的转变是其整个生命周期中关键性的发育转变，花芽分化的起始（茎尖生长锥由营养分生组织转变成生殖分生组织）作为这一关键性发育转变的开端，由于一直以来缺少可比较的相对准确的性状指标，花芽分化起始期是发育学中的“黑匣子”。关于棉花开花时间和花芽分化起始的认识目前仅停留在棉株形态的变化，缺少该发育过程的细胞生物学证据。　　本研究通过分析100个不同熟性的棉花品种田间生育期和开花时间与第一果枝节位之间的相关性，明确了第一果枝节位与开花时间和生育期之间的关系。通过制作10个不同熟性棉花品种在第一至六片真叶期，共六个时期棉苗茎尖的石蜡切片，对比观察了棉花不同熟性的品种在花芽分化起始期顶端分生组织的细胞组织结构变化，并通过检测开花调控关键基因在幼苗期的转录水平变化，对比了开花调控关键基因在不同熟性棉花品种幼苗期的表达变化趋势差异，综合分析判断棉花花芽分化的起始时间及其标志性状，结合田间不同熟性棉花品种生育期、开花时间与第一果枝节位之间相关性的统计学分析结果，完善了棉花开花时间的细胞形态学、分子水平及田间统计学证据。本研究获得的主要结果如下:　　1.分析共100个不同熟性的棉花品种在江苏盐城、沧州青县、湖北荆州和河南安阳四个种植地点，2014年和2015年两个年份的生育期、开花时间与第一果枝节位之间的相关性，分析结果显示开花时间与第一果枝节位两者相关指数R2=0.63，表明棉花第一果枝节位与开花时间两个性状之间呈显著的正相关，即第一果枝节位越少开花越早;第一果枝节位与生育期之间的相关指数R2=0.38，也呈现出显著的正相关性，但比开花时间与第一果枝节位的相关性弱。　　2.检测田间种植的8个早熟和8个晚熟共16个棉花品种中开花时间整合子GhSOC1和GhFT在幼苗期的表达趋势。结果显示GhSOC1和GhFT基因在早熟品种中在第三片真叶萌发后表达量开始升高，而部分晚熟品种在第五片真叶展开时这两个开花调控的关键基因表达才开始升高，导致在第3次和第4次取样时GhSOC1和GhFT在早熟品种中的表达显著高于晚熟品种，表明早熟品种花芽分化的起始明显早于晚熟品种，花芽分化起始的时间决定了棉花开花早晚。　　3.制作5个早熟和5个晚熟共10个棉花品种在第一至六片真叶期的茎尖石蜡切片共180张（每个品种的每个叶龄期均设3个重复），观察茎尖分生组织纵截面的细胞组织结构变化，发现早熟品种在第三片真叶期便发生了花芽分化的起始（茎尖顶端分生组织生长锥向外突起，茎尖由平滑直线转变成曲线），而晚熟品种分别在第四、五片真叶期才发生。　　以上结果综合分析表明，棉花花芽分化的起始发生在幼苗期，决定着生殖生长的起始，这一关键发育过程可根据叶龄预测;第一果枝节位可作为评价棉花开花时间的重要标准。本研究填补了棉花花芽分化起始过程的细胞生物学证据的空白;结合田间不同熟性棉花品种生育期、开花时间与第一果枝节位之间相关性的统计学分析结果，本研究为以第一果枝节位评价棉花早熟性的可靠性提供了细胞、分子及统计学依据，为深入开展棉花熟性分子研究提供了重要的理论依据。

关键词： SPOP蛋白   卵巢癌   Hh信号通路   细胞凋亡   细胞增殖  

摘要： 背景/目的:卵巢癌是人类女性三大妇科恶性肿瘤之一,由于卵巢癌的发生一般无明显症状体征,约 70%患者最后发现时已处于癌症晚期,并伴随着腹膜转移和淋巴结转移,故卵巢癌居妇科恶性肿瘤死因的首位.80-90%原发性卵巢恶性肿瘤为卵巢上皮癌.目前,卵巢癌的主要治疗手段有手术减瘤、铂类+紫杉醇化疗、放疗,但是卵巢癌症晚期患者的 5 年存活率仍然很低.因此,我们有必要对卵巢癌的发病机制、有效的治疗靶点进行研究.SPOP 是E3泛素连接酶斑点型锌指结构蛋白(speckletype POZ protein),它能够特异性识别底物蛋白,使底物蛋白泛素化,并通过蛋白酶体途径降解,参与了多种生理、病理过程.Hh信号通路在包括卵巢癌在内的几乎所有肿瘤中都存在异常高度激活.本文就SPOP与Hh信号通路的关系以及SPOP对上皮性卵巢癌细胞的的作用机制进行了初步探讨.　　方法:(1)用免疫组化方法检测人类正常卵巢组织和上皮性卵巢癌组织中SPOP蛋白表达情况,并根据SPOP在卵巢癌组织中表达情况和临床病理特征做相关性分析.　　(2)构建过表达和敲低SPOP基因的慢病毒载体,转入到稳定表达SPOP蛋白的人类上皮性卵巢癌细胞株OVCAR-3中.用qRT-PCR和western blotting检测转染效率.　　(3)用western blotting检测增殖细胞核抗原(PCNA),平板克隆形成实验和EDU实验检测稳定过表达和敲低SPOP的OVCAR-3细胞的增殖能力.　　(4)用透射电镜观察过表达SPOP的OVCAR-3细胞株中凋亡小体,western blotting 检测过表达和敲低 SPOP 的 OVCAR-3 中凋亡相关蛋白(Bcl2、Bax、caspase3、cleaved-caspase3)的表达,从而检测SPOP对上皮性卵巢癌细胞的凋亡影响.　　(5)用qRT-PCR和western blotting法检测过表达和敲低SPOP的OVCAR-3细胞株中,Hh 信号通路相关基因和蛋白(Gli1、Gli2、PTCH1、SuFu)的表达变化.　　(6)用 Hh 信号通路 Gli1、Gli2 特异性抑制剂 GANT61 处理敲低 SPOP 的OVCAR-3细胞株,并用western blotting法检测Gli1和Gli2的变化.　　(7)用流式细胞术检测GANT61处理后,SPOP敲低细胞株凋亡变化情况.　　结果:(1)与人类正常卵巢上皮组织相比,上皮性卵巢癌组织中SPOP表达明显下调.在卵巢癌组织中,SPOP蛋白的表达量与患者的FIGO分期和病理等级呈负相关.　　(2)在OVCAR-3细胞株中转染载有干扰SPOP表达的慢病毒之后,细胞的增殖能力相对于空载对照组细胞明显增强.相反,过表达SPOP的细胞增殖能力明显减弱.　　(3)在OVCAR-3细胞株中转染载有SPOP过表达的慢病毒,会导致细胞出现凋亡.并且干扰 SPOP 表达后,凋亡相关蛋白中促凋亡蛋白( Bax、cleaved-caspase3)减少,抑制凋亡蛋白(Bcl2)增加.相反,转染了过表达SPOP的细胞株中,促凋亡蛋白增加,抑制凋亡蛋白减少.　　(4)用qRT-PCR检测敲低SPOP的OVCAR-3细胞株中,Gli2基因表达增加, Gli1、PTCH1、SuFu变化不明显.但在过表达SPOP的OVCAR-3中,Gli2基因表达减少,Gli1、PTCH1、SuFu变化均不明显.　　(5)用western blotting检测敲低SPOP的OVCAR-3细胞株中, Gli1、Gli2、SuFu蛋白表达增加,PTCH1变化不明显.相反在过表达SPOP的细胞中,Gli1、Gli2、SuFu蛋白表达减少,PTCH1变化不明显.　　(6)用 Hh 信号通路 Gli1、Gli2 特异性抑制剂 GANT61 处理敲低 SPOP 的OVCAR-3细胞株, western blotting检测发现Gli1和Gli2蛋白表达降低.　　(7)用流式细胞检测细胞凋亡.发现用GANT61处理敲低SPOP的OVCAR-3细胞株,相对于不加GANT61处理的细胞株来说,细胞的凋亡率有所增加.同时, SPOP敲低组的细胞株相对于空载对照组细胞,凋亡率明显减少.　　结论:SPOP可以通过抑制Hh信号通路从而促进卵巢癌细胞OVCAR-3凋亡.但是,SPOP在卵巢癌中发挥抑癌作用的深入的机制还需要进一步研究.SPOP可以作为诊断治疗卵巢癌可能的潜在新靶点.

关键词： 海洋细菌   胞外多糖   抗肿瘤作用   蛋白质组学   细胞生物学  

摘要： 癌症作为世界范围内的主要公共卫生问题之一，严重威胁人类生命健康，并且其发病率和死亡率均呈现持续攀升的趋势。其中，转移作为癌症患者预后不良的重要因素，仍然是恶性肿瘤患者的主要死因之一。目前，针对肿瘤转移的临床治疗手段主要是化学治疗，然而市场上大多数化疗药物都存在一定的毒副作用。长期的化疗会诱导癌细胞产生耐药性，将进一步降低化疗药物在肿瘤临床治疗中的效果。海洋微生物多糖因其具有生物相容性好，低毒以及容易获得等优势，已经成为海洋科学研究的重点之一，能够为研发高效低毒的抗肿瘤转移新药提供候选化合物。EPS11是实验室前期发现的一种有抗肿瘤效果的海洋细菌多糖，具有潜在的抗肿瘤转移的潜力，但相应的分子机制并不清晰。本论文结合蛋白质组学、细胞生物学等手段从体外和体内两个层次详细研究了EPS11抗肿瘤转移的分子机制，为开发多糖类抗肿瘤转移药物提供了可靠的理论依据和药物前体。　　本研究首先通过MTT法检测EPS11对多种肝癌细胞的毒性，表明其能够浓度和时间依赖性地抑制肝癌细胞Huh7.5、Bel-7402和HepG2的增殖。同时，利用光学显微镜观察发现EPS11能够引起肝癌细胞Huh7.5、Bel-7402和HepG2的聚集成团、脱黏附。进而，通过结晶紫染色法定量检测了EPS11对肝癌细胞黏附率的影响，并利用扫描电镜(SEM)观察了EPS11对细胞表面结构的作用。结果显示，EPS11能够浓度和时间依赖性地降低肝癌细胞的黏附能力，破坏肝癌细胞表面的伪足状结构。细胞黏附率的降低与细胞伪足状结构数量的减少相一致，表明细胞表面伪足状结构在肝癌细胞黏附方面扮演着重要的角色。为了深入探究EPS11抑制肿瘤细胞转移的功能，本研究进一步利用划痕和Transwell实验证明了EPS11能够通过降低肝癌细胞Huh7.5的黏附能力并破坏其表面结构而抑制肝癌细胞Huh7.5的迁移。　　本研究通过蛋白质组学全面分析了EPS11对肝癌细胞Huh7.5生物学的进程影响，进一步揭示EPS11抑制肝癌细胞Huh7.5生长增殖和转移的机制。通过数据分析发现EPS11作用Huh7.5细胞后，大量细胞黏附分子的表达水平显著下调。其中，细胞黏附分子CD99下调最为显著。由于CD99在细胞增殖、黏附、迁移以及分化等方面均发挥重要的作用，将其作为EPS11作用的关键效应分子进行深入研究。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting对蛋白质组的结果进行验证，发现EPS11在mRNA和蛋白水平上均能够显著下调CD99的表达，尤其是在蛋白水平。进而在肝癌细胞Huh7.5中过表达CD99分子，并检测此时EPS11对肝癌细胞Huh7.5增殖率、黏附能力和迁移能力的影响，进而验证CD99在EPS11抑制肝癌细胞Huh7.5增殖和迁移进程中的重要性。结果表明，过表达CD99能够部分逆转EPS11引起的肝癌细胞Huh7.5增殖率、黏附能力和迁移能力的降低，进一步证实CD99在EPS11的抗肝癌转移机制中发挥着重要作用，同时也为CD99作为肝癌靶向治疗的重要标志分子提供了证据。　　为进一步探究EPS11在体内抑制肿瘤细胞转移的效果，本研究采用黑色素瘤细胞肺转移小鼠模型进行验证。与对照组相比，注射了EPS11后能够显著减少小鼠体内黑色素瘤细胞的肺部转移灶，但并不影响小鼠的体重等生长指标，证实了EPS11在动物体内具有良好的抗肿瘤转移的作用效果，是一个潜在的抗肿瘤转移候选药物。