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关键词： Glioblastoma   Cancer stem cell   Self-renewal   Chemoresistance   Wnt   Notch  

摘要： Glioblastoma multiforme (GBM) is among the most incurable cancers. GBMs survival rate has not markedly improved, despite new radical surgery protocols, the introduction of new anticancer drugs, new treatment protocols, and advances in radiation techniques. The low efficacy of therapy, and short interval between remission and recurrence, could be attributed to the resistance of a small fraction of tumorigenic cells to treatment. The existence and importance of cancer stem cells (CSCs) is perceived by some as controversial. Experimental evidences suggest that the presence of therapy-resistant glioblastoma stem cells (GSCs) could explain tumor recurrence and metastasis. Some scientists, including most of the authors of this review, believe that GSCs are the driving force behind GBM relapses, whereas others however, question the existence of GSCs. Evidence has accumulated indicating that non-tumorigenic cancer cells with high heterogeneity, could undergo reprogramming and become GSCs. Hence, targeting GSCs as the "root cells" initiating malignancy has been proposed to eradicate this devastating disease. Most standard treatments fail to completely eradicate GSCs, which can then cause the recurrence of the disease. To effectively target GSCs, a comprehensive understanding of the biology of GSCs as well as the mechanisms by which these cells survive during treatment and develop into new tumor, is urgently needed. Herein, we provide an overview of the molecular features of GSCs, and elaborate how to facilitate their detection and efficient targeting for therapeutic interventions. We also discuss GBM classifications based on the molecular stem cell subtypes with a focus on potential therapeutic approaches.

关键词： 瘢痕疙瘩   HTRA1   TGF-β1活化   成纤维细胞衰老   miR-494-3p  

摘要： 目的:瘢痕一直以来都是整形外科领域的一大难题。创伤后过度的修复会导致病理性瘢痕的形成,病理性瘢痕主要包括瘢痕疙瘩和增生性瘢痕。TGF-β1是伤口愈合后强有力的生长因子,被认为是瘢痕疙瘩和其他纤维化疾病的关键调控因子,TGF-β1与TGF-β受体结合后将激活信号传导到细胞核内,激发多种信号转导途径,来调控瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖过程。HTRA1是一种热激性蛋白,属于HTRA家族成员之一。研究发现,HTRA1在肿瘤中具有剪切细胞内TGF-β1前体进而抑制TGF-β1信号通路的作用。鉴于HTRA1为TGF-β1的抑制基因,且HTRA1的异常表达与众多肿瘤有关,尽管瘢痕疙瘩没有恶性征象,但其某些特征包括超出原有创伤范围、持续性生长并极易复发等又与恶性肿瘤有一定相似性。因此,本研究旨在首先明确HTRA1在瘢痕疙瘩中的表达水平、生物学功能以及潜在作用机制。然后在前期工作的基础上。进一步研究靶向HTRA1的miRNA对瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学功能的影响。方法:在HTRA1研究阶段,从组织水平,收集瘢痕疙瘩和正常皮肤组织各26例,应用RT-PCR、western blot和免疫组化技术检测HTRA1和TGF-β1的表达水平差异;从细胞内分子信号水平,应用细胞共培养、荧光素酶报告基因实验,研究HTRA1在瘢痕疙瘩形成过程中对TGF-β1活化的调控机制;应用慢病毒介导的基因沉默靶向抑制HTRA1或者TGF-β1,模拟靶向治疗瘢痕疙瘩的尝试,并研究HTRA1在瘢痕疙瘩中可能同时存在的TGF-β1非依赖调控机制;应用细胞衰老实验,研究HTRA1通过影响细胞衰老发挥TGF-β1非依赖的调控机制。在进一步研究HTRA1上游调控机制中,首先利用在线生物信息学软件(TargetScan,Pictar和MicroRNA)预测靶向HTRA1的miRNA,然后利用荧光素酶报告系统验证HTRA1是miR-494-3p的靶基因。在组织水平,应用RT-PCR检测miR-494-3p的表达水平。通过原代培养瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞,采用Lipofectamine 2000转染miR-494-3p mimic和miR-494-3p inhibitor,从而过表达miR-494-3p或降低miR-494-3p表达。MTT法检测miR-494-3p不同表达水平的瘢痕疙瘩成纤维细胞活力变化。流式细胞术检测miR-494-3p不同表达水平的瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡和细胞周期的变化。Transwell侵袭实验检测miR-494-3p不同表达水平的瘢痕疙瘩成纤维细胞侵袭能力的变化。Western blot实验检测miR-494-3p不同表达水平的瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成能力的变化。结果:1、Real time PCR检测结果显示,HTRA1和TGF-β1在正常组织和瘢痕疙瘩中均表达,但HTRA1和TGF-β1的mRNA表达在瘢痕疙瘩中明显高于正常皮肤,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot和免疫组织化学染色均可以检测到瘢痕疙瘩和正常皮肤中HTRA1和活性TGF-β1的蛋白表达,但HTRA1和活性TGF-β1的表达在瘢痕疙瘩中明显高于正常皮肤,差异有统计学意义(P<0.05)。2、正常皮肤组织和瘢痕疙瘩中均可以检测到Smad2总蛋白以及磷酸化Smad2;和正常组织相比,瘢痕疙瘩Smad2总蛋白含量没有发生明显变化,磷酸化Smad2(p-Smad2)水平显著高于正常皮肤组织,差异有统计学意义(P<0.05)。荧光素酶报告基因结果显示,活性TGF-β1可以特异性的激活PAI-1启动子介导的荧光素酶基因表达而非活性TGF-β1则不能激活荧光素酶基因的表达。单独暴露于重组人HTRA1(rhHTRA1)或非活性TGF-β1的成纤维细胞中Smad2磷酸化水平和活性TGF-β1量均明显升高,rhHTRA1和latent TGF-β1共同处理进一步增强瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad2的磷酸化和活性TGF-β1的含量。3、干扰HTRA1或TGF-β1明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,干扰HTRA1比单独干扰下游TGF-β1对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖具有更好的抑制效果。4、敲除HTRA1可以显著增强β-半乳糖苷酶活性,在基因敲除HTRA1的瘢痕疙瘩成纤维细胞中过表达S328A突变型HTRA1并未能逆转细胞衰老,抑制HTRA1而非TGF-β1能诱导成纤维细胞衰老。5、通过生物信息学分析我们发现瘢痕疙瘩成纤维细胞中HTRA1是miR-494-3p的潜在靶基因.荧光素酶活性结果显示,miR-494-3p能够与HTRA1 3’UTR上的结合位点结合而抑制荧光素酶的表达。6、miR-494-3p在正常皮肤组织和瘢痕疙瘩中均表达,在瘢痕疙瘩组织中的表达显著降低(P<0.05)。7、采用miR-494-

关键词： 细胞培养   MH7A   条件培养基   TNF-α   人脐静脉内皮细胞   MH7A条件培养基   栀子苷   条件培养基   人脐静脉内皮细胞   细胞通透性  

摘要： 第一部分条件培养基的制备及其对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)生物学功能的影响目的:体外培养MH7A,建立肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)诱导MH7A炎症损伤模型,制备来自MH7A的条件培养基。确定MH7A条件培养基诱导HUVEC的适宜浓度,并观察MH7A条件培养基对HUVEC生物学功能的影响及其产生作用的机制。方法:MH7A体外成功培养后,用浓度为2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL的TNF-α作用促进其增殖。CCK-8法检测TNF-α作用后MH7A的增殖活性以确定适宜的造模浓度。造模24 h后,提取MH7A培养液,并且从澄清度、无菌、pH值等方面对提取的培养液进行质量评价。HUVEC体外成功培养后,HUVEC经过不同浓度MH7A条件培养基诱导后,CCK-8法检测不同组HUVEC增殖活性以确定MH7A条件培养基诱导HUVEC的适宜浓度。采用条件培养基和普通培养基分别对实验组和对照组诱导24 h,采用CCK-8法、细胞划痕、细胞迁移法观察HUVEC增殖和迁移活性的变化,ELISA法检测HUVEC上清中血管紧张素-1(Angiotensin,Ang-1)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)和血管抑素(Angiostatin,AS)分泌量、蛋白质电泳法(Western-blot)法和RT-qPCR检测HUVEC中S1P-S1PR1及其下游RhoA-F-actin-NF-κB信号通路中关键蛋白S1PR1、RhoA、F-actin、NF-κB p65等的蛋白及mRNA表达量。结果:浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的TNF-α均都能诱导MH7A增殖,10 ng/mL的TNF-α为造模的适宜浓度。提取的培养基为粉红色的澄清透明溶液,无菌、pH值为7.28±0.12,该溶液pH在多数细胞培养的适宜值(7.2-7.4)。CCK-8结果证明MH7A条件培养基原液、二倍及四倍稀释液均能诱导HUVEC增殖,在后续实验部分均采用MH7A条件培养基原液作为刺激物。经MH7A条件培养基诱导后,HUVEC增殖和迁移能力显著增加。HUVEC中促血管生成因子Ang-1、FGF分泌量升高,抑血管生成因子AS分泌水平下降,使促/抑血管生成因子动态平衡向促进血管新生方向移动。Western blot法检测S1PR1、RhoA、F-actin、NF-κB p65和NF-κB p-p65的蛋白表达量均上升。RT-qPCR检测HUVEC中S1PR1、RhoA、F-actin和NF-κB p65的mRNA表达量明显增加。结论:成功制备来自于MH7A的符合细胞培养基本要求的条件培养基。来自MH7A的条件培养基可成功诱导HUVEC增殖和迁移。MH7A条件培养基具有促进HUVEC血管新生的作用,其作用机制是通过活化S1P-S1PR1及其下游RhoA-F-actin-NF-κB信号通路实现的。第二部分栀子苷(Geniposide,GE)对MH7A条件培养基诱导的HUVEC生物学功能改变的治疗作用目的:探讨经GE给药后对条件培养基诱导的HUVEC生物学功能改变的治疗作用及其作用机制。方法:HUVEC经MH7A条件培养基诱导24 h,加入浓度为6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM的GE溶液作用24 h后,CCK-8法检测HUVEC的增殖活性以确定GE适宜给药浓度。采用细胞划痕、细胞迁移法观察给药后HUVEC迁移能力的变化,ELISA法检测HUVEC上清中Ang-1、FGF和AS分泌量、荧光染色法观察HUVEC中F-actin的形态和分布、Western-blot法和RT-q PCR检测MH7A条件培养基诱导的HUVEC中S1P-S1PR1及其下游Rho A-F-actin-NF-κB信号通路中关键蛋白S1PR1、Rho A、F-actin及NF-κB p65的蛋白表达量及RNA表达量。结果:经GE给药后,HUVEC的异常增殖反应得到抑制,且浓度为25μM、50μM、100μM的GE溶液作用较为显著。故以上三个剂量被用于之后的实验。且HUVEC增加的增殖活性和迁移能力均被GE显著抑制。HUVEC中失去动态平衡的促/抑血管生成因子得到改善,不同程度下调促血管生成因子Ang-1和FGF水平,上调抑血管生成因子AS水平。Western blot和RT-q PCR法检测S1PR1、Rho A、F-actin及NF-κB p65上升的蛋白和m RNA表达量均明显下调。结论:GE明显改善MH7A条件培养基对HUVEC的诱导作用,并

关键词： ZAK   乳腺癌   迁移   增殖   凋亡  

摘要： 目的:乳腺癌是女性发病率最高的一种恶性肿瘤,迄今为止对乳腺癌发病的确切原因和发病机理尚不清楚。新资料发现,随着人们生活方式转变,乳腺癌发病率逐年上升且趋势呈现年轻化。虽然近年来乳腺癌的影像学检查、放疗、化疗、内分泌治疗和免疫治疗策略以及手术方式不断发展,但其生存率并无明显改善。所以,深入研究乳腺癌发病的分子机制,对乳腺癌早期诊断、治疗及临床预后都有着重要的意义。MAPK(mitogen-activated protein kinase,丝裂原活化蛋白激酶)是细胞内广泛表达的蛋白激酶,ZAK位于MAPK信号通路的上游,细胞中的过表达能激活MAPK信号通路。其信号传导途径的异常也可导致细胞生长失控和肿瘤发生。可见ZAK通过对MAPK等途径的调控,广泛影响了真核细胞的生命过程,具有重要的研究意义。在前期工作中我们利用TCGA和Oncomine公共数据库分析了ZAK在乳腺癌中的表达情况,初步发现ZAK在乳腺癌中存在着异常表达,提示ZAK可能与乳腺癌的发生发展有关,然而,ZAK在乳腺癌中的作用机制尚不明确,有待深入研究阐明。方法:从293T细胞中提取总RNA,逆转录出cDNA,根据ZAK的CDS序列设计含有Xho I和BamH I限制性内切酶位点的引物序列,PCR扩增目的基因,将双酶切得到目的片段连接到慢病毒表达质粒PLVX-IRES-Puro中,分别获得重组的稳定过表达ZAK载体和慢病毒干扰ZAK-shRNA载体;用293T细胞包装重组病毒颗粒并感染MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞,经puromycin筛选获得稳定转染细胞株。Realtime PCR和Western Blot分别检测ZAK mRNA水平及蛋白表达;随后利用实时无标记细胞分析仪(RTCA)检测过表达ZAK和干扰ZAK表达乳腺癌细胞株的增殖和迁移情况;并采用CCK-8增殖实验来进一步评估ZAK对乳腺癌细胞生长的相关性;最后用AnnexinV/PI试剂盒检测ZAK对细胞凋亡的影响,FlowJo软件分析结果,以探讨ZAK对乳腺癌细胞凋亡生物学行为的影响。结果:1.过表达ZAK的MDA-MB-231细胞株和MCF-7细胞株,其ZAK mRNA表达较对照组明显上调(P<0.01);干扰表达ZAK的两株乳腺癌细胞其ZAK mRNA表达较对照组都显著下调(P<0.05)。2.过表达ZAK的MDA-MB-231细胞株和MCF-7细胞株的增殖能力与对照组相比明显提高(P<0.01),迁移率显著增强(P<0.01);而干扰表达ZAK的两个乳腺癌细胞株的增殖能力与对照组相比都明显下降(P<0.01),其迁移率也明显减弱(P<0.01)。3.过表达ZAK的MDA-MB-231和MCF-7细胞株的凋亡率与对照组相比,显著降低(P<0.01);而干扰表达ZAK的两个乳腺癌细胞株的凋亡率与对照组相比,显著上升(P<0.01)。结论:***促进乳腺癌细胞的增殖和迁移,抑制细胞凋亡;***基因沉默后可抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移,促进细胞凋亡

关键词： 网络资源   医学细胞生物学   课程建设  

摘要： 医学细胞生物学是一门重要医学基础课程,是其他医学基础课程和临床课程的桥梁,但课程内容深奥、难懂,知识更新速度快,课程又不是考研和执业医师考试内容,导致教学存在难题。而当今社会,网络资源非常丰富,针对课程特点和网络资源的优势,有效利用网络资源为医学细胞生物学的教学服务是解决这一难题的有效途径,在教学中适时使用国际和国内网络资源使细胞生物学课程充满了生机和趣味性,让学生既掌握了本课程的基础知识,又培养了科研创新思维,起到了医学基础桥梁课程的作用。随着生命科学和医学的高速发展,授课教师应该在课程建设过程中不断更新网络资源,让更多的医学生受益于此课程。

关键词： 阿司匹林   结直肠癌   TIGIT   增殖   迁移   阿司匹林   Jurkat细胞   TIGIT   增殖   凋亡  

摘要： 结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤,也是一种由多种因素引起的恶性疾病。阿司匹林(Aspirin,ASA)作为经典解热镇痛抗炎药,主要应用于心脑血管疾病之中。有心血管疾病预防试验数据表明,常规服用阿司匹林能够降低约40%结肠癌的发病率,但其预防结肠癌发生的机制目前尚不清楚。T细胞免疫球蛋白域和免疫受体酪氨酸抑制基序蛋白(T cell immunoglobulin and ITAM domain,TIGIT)是近年来发现的协同共抑制分子,在诱导T细胞免疫耐受及肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用,CD155是TIGIT的受体,TIGIT-CD155信号通路介导细胞负性调控。本课题研究阿司匹林通过TIGIT-CD155信号通路调控肿瘤细胞和免疫细胞生物学特性对结直肠癌的作用机制进行探讨。第一部分阿司匹林通过TIGIT-CD155信号通路调控结肠癌细胞生物学功能的研究目的探讨TIGIT、CD155在结直肠癌组织和结肠癌细胞中的表达,并研究阿司匹林调控TIGIT-CD155信号通路对结肠癌细胞生物学功能的影响。方法收集来自宁夏医科大学总医院病理科的结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织,并制成石蜡切片。采用免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)检测TIGIT、CD226和CD155的表达。采用蛋白质免疫印迹实验(Western Blot,WB)检测不同结肠癌HT-29、SW480、SW620和HCT116细胞株TIGIT和CD155的表达。CCK8实验、划痕实验、Transwell实验和流式细胞术检测不同浓度阿司匹林(2 mMol/L、4 mMol/L、8 mMol/L)干预结肠癌HT-29细胞株0 h、24 h、48 h和72 h,观察阿司匹林对结肠癌细胞活性、迁移能力和细胞凋亡的影响。WB检测不同浓度阿司匹林干预结肠癌细胞48 h后,观察迁移相关蛋白MMP9和FAK的表达,凋亡相关蛋白BAX和Bcl2的表达,TIGIT-CD155信号通路中TIGIT和CD155蛋白的表达;以及阿司匹林浓度为8 mMol/L(IC50)下分别干预24 h、48 h和72 h后观察迁移相关蛋白MMP9和FAK,凋亡相关蛋白BAX和Bcl2,TIGIT-CD155信号通路中TIGIT和CD155蛋白的表达。酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测不同浓度阿司匹林干预结肠癌HT-29细胞后,培养细胞上清中TGF-β1和IL-10的表达。结果IHC结果显示:TIGIT和CD155在结直肠癌肿瘤组织中的表达显著高于癌旁组织,CD226未在肿瘤细胞上表达。WB检测结果显示:结肠癌细胞株HT-29、SW480、SW620和HCT116上均表达TIGIT和CD155。CCK8实验结果显示:在同一时间下,随着阿司匹林作用浓度的增加结肠癌细胞细胞活性显著降低;在同一浓度下,随着阿司匹林作用时间的延长结肠癌细胞细胞活性显著降低,阿司匹林的作用呈时间和剂量依赖性。划痕实验和Transwell实验结果显示:随着阿司匹林作用浓度和作用时间的延长,阿司匹林能够显著抑制结肠癌细胞的迁移能力。流式细胞术检测结果显示:随着阿司匹林浓度的增加结肠癌细胞凋亡率增高。WB检测结果显示:不同浓度的阿司匹林干预48 h后,肿瘤迁移相关蛋白MMP9和FAK的表达下调;抑凋亡蛋白Bcl2的表达下调,而促凋亡蛋白BAX表达上调;TIGIT-CD155信号通路中TIGIT的表达下调,CD155的表达没有显著改变。阿司匹林浓度为8mMol/L时,随着作用时间的延长肿瘤迁移蛋白MMP9和FAK的表达下调,促凋亡蛋白BAX的表达上调,抑制凋亡蛋白Bcl2蛋白下调;TIGIT-CD155通路中TIGIT的表达下调,CD155的表达没有显著改变。ELISA结果显示:在同一时间下,不同浓度阿司匹林处理结肠癌细胞后,细胞因子TGF-β1和IL-10的分泌量增加。结论TIGIT、CD155的表达与肿瘤的生物学功能相关,阿司匹林通过抑制TIGIT-CD155信号通路影响肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移,从而达到预防肿瘤的目的。第二部分阿司匹林通过TIGIT-CD155信号通路调控免疫细胞生物学功能的研究目的探讨TIGIT、CD155在免疫细胞上的表达,并研究阿司匹林调控TI G IT-CD 155信号通路对T淋巴细胞白血病细胞系(J u r k a t细胞)细胞生物学功能的影响。方法收集来自宁夏医科大学总医院病理科的CRC患者肿瘤组织和癌旁组织,并制成石蜡切片。采用IHC检测TIGIT、CD226和CD155在肿瘤浸润性淋巴细胞上的表达。CCK8实验和流式细胞术检测不同浓度ASA(1 m Mol/L、2m M

关键词： NRP2   B-CPAP细胞   RNAi   生物学功能  

摘要： 背景和目的:甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)是甲状腺肿瘤中最常见的病理类型,可以在早期发病时就发生淋巴结转移,而目前关于甲状腺乳头状癌的淋巴结转移机制的研究尚未明确,因此,需要一个可靠的生物学标志来预测PTC的淋巴结转移,为甲状腺乳头状癌的治疗提供生物学指导。神经纤毛蛋白-2(Neuropilin2,NRP2)是一种单跨膜糖蛋白,是神经纤毛蛋白(Neuropilins,NRPs)家族中的成员之一。通过和血管内皮细胞(VEGF)受体结合,启动VEGF内细胞信号转导,调节神经元发育、淋巴管生成、以及血管生成等多种生理过程。此前有研究证实,NRP2在多种肿瘤中高表达,例如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、骨肉瘤等。体外实验结果表明NRP2可以在大多数肿瘤中促进淋巴管生成及血管生成,抑制其表达之后的癌细胞增殖减少,迁移及侵袭力下降,从而认为NRP2在恶性肿瘤的发展中起着重要作用。目前,国内外尚无关于甲状腺乳头状癌与NRP2之间的相关性研究。肿瘤发生淋巴结转移主要与淋巴管内皮结构疏松及基底膜的连续性差的特征有关。淋巴结转移是甲状腺乳头状癌的主要转移方式。近年来的研究显示,血管内皮细胞中的某些因子例如VEGF-C等可以导致淋巴管的扩张,增加肿瘤细胞的淋巴结转移数量。D2-40在血管内皮中不表达,特异性标记的淋巴管内皮,可以作为计数淋巴管密度(MLD,microlymphatic density)的指标帮助研究甲状腺乳头状癌淋巴结转移的机制。所以本次实验采用免疫组化观察NRP2在甲状腺乳头状癌组织中的表达情况,D2-40标记微淋巴管密度,并通过统计分析NRP2表达与PTC的相关性,分析其与甲状腺乳头状癌的淋巴结转移以及各临床参数之间的联系,包括年龄、性别以及有无淋巴结转移。构建有效抑制NRP2表达的RNAi序列,探讨沉默NRP2表达后对B-CPAP细胞的增殖,迁移以及侵袭等生物学行为的影响,进一步探索甲状腺乳头状癌淋巴结转移机制,旨在为PTC的治疗和提高预后提供新的靶标。方法:1.从郑州大学第一附属医院病理科资料库中筛选2011年-2016年之间的甲状腺乳头状癌组织标本62例以及甲状腺腺瘤30例。采用免疫组化实验方法检测石蜡标本中NRP2在甲状腺乳头状癌以及甲状腺腺瘤旁正常甲状腺组织中的蛋白表达情况。用单克隆抗体D2-40标记微淋巴管密度。2.设计合成siRNA序列,筛选出1条能够最有效抑制NRP2表达的序列,由吉凯基因公司包装成的慢病毒颗粒进行细胞转染,分为实验组LV-NRP2-RNAi、阴性对照组NRP2-siRNA-control。3.采用免疫蛋白印迹技术检测病毒转染后的NRP2蛋白表达的变化情况。***-8法检测PTC细胞转染前后各实验组增殖情况的改变。5.采用细胞划痕实验通过不同时间段对细胞的观察计算转染后各实验组细胞迁移能力的改变。***检测PTC细胞转染后阴性对照组和实验组的细胞侵袭能力的变化情况。7.统计分析,所有数据均用SPSS21.0软件处理,计量资料均采用均数±标准差(Mean±SD)的形式表示,采用卡方检验分析组间数据的相关性。检验水准为α=0.05.。结果:1.免疫组化实验结果显示NRP2在甲状腺乳头状癌组织中蛋白呈阳性及强阳性表达,在正常甲状腺组织中呈阴性表达,差异有统计学意义(P<0.05),统计分析结果显示NRP2的阳性表达与PTC的淋巴结转移有关(P<0.05),和年龄以及性别无明显相关性(P>0.05)。D2-40在有淋巴结转移的癌组织中的MLD为13.61±6.05,与未转移的甲状腺乳头状癌组织中的MLD 8.26±4.32相比有显著差异(P<0.05)。NRP2与D2-40的相关系数R=0.41,呈显著正相关(P<0.05)。***结果显示病毒转染72小时后的甲状腺乳头状癌细胞的转染组LV-NRP2-RNAi蛋白表达量0.43±0.08,阴性对照组为0.90±0.08,未处理组为0.98±0.15。未处理组与阴性对照组无显著差异,差异无统计学意义(P>0.05)。转染组与阴性对照组相比,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。实验组LV-NRP2-RNAi低于阴性对照组NRP2-siRNA-control,抑制率达到47.7%。***-8细胞增殖实验结果显示,转染后的B-CPAP细胞,NRP2的表达下调使得转染组LV-NRP2-RNAi的细胞增殖明显降低,在48h,72h,96h,与阴性对照组相比差异显著,有统计学意义,P<0.05,而阴性对照组,与未处理组差别不大,无统计学意义(P>0.05)。4.细胞划痕实验结果显示在1d、2d、3d的同一时间实验组LV-NRP2-RNAi的细胞划痕愈合率低于阴性对照组,差异

关键词： NK/T-cell   淋巴瘤   miR-148a-3p   生物学功能  

摘要： 背景NK/T细胞淋巴瘤(Natural Killer/T cell lymphoma,NK/Tcl)是一类预后较差的非霍奇金淋巴瘤亚型,大部分来源于成熟的NK细胞,少部分来源于NK样T细胞,细胞表型具有高度异质性、复杂多样性。NK/Tcl好发于上呼吸道及消化道,临床表现各异,进展迅速,频繁复发,但诊疗进展缓慢。目前还缺乏更加有效的治疗靶点。MicroRNA(miRNA)是非编码RNA的重要组成部分,通过RNA的降解和(或)抑制翻译来调控基因表达。miRNA在肿瘤细胞和肿瘤细胞微环境的联系间起着重要作用,通过调控各种分子信号通路,释放肿瘤细胞因子或生长因子,从而调控肿瘤的发生发展。研究发现,部分miRNA在特定肿瘤中可发挥癌基因和抑癌基因的功能。MiR-148a是miR-148/miR-152家族的成员,该家族是由三个高度保守的、成熟的miRNA组成,分为miR-148a、miR-148b及miR-152。miR-148a是一种新型的肌源性miRNA,可通过作用于靶蛋白ROCK1促进成肌细胞和骨骼肌细胞分化。同时,miR-148a可作用于不同的靶基因发挥其在各种肿瘤中的功能。近年来研究发现,miR-148a在胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌中均检测到表达下调,而在骨肉瘤中的表达上调。且发现miR-148a在不同肿瘤细胞中可发挥癌基因或抑癌基因作用。而目前有关miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤中的作用无相关研究的报道,本文拟对miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤中的生物学功能进行研究。目的鉴于miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞中无相关研究报道。本文拟以体外实验方法对miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞的表达及功能进行研究。进一步阐明miR-148a-3p功能并以寻找NK/T细胞淋巴瘤新的治疗靶点。方法***/T细胞淋巴瘤细胞株NK92细胞及YT细胞均由淋巴瘤重点实验室(张明智,郑州大学第一附属医院肿瘤科)馈赠,正常人NK细胞株购于中国科学院细胞库。以慢病毒为介导的LV3-miR-148a-3p mimics过表达及LV3-miR-148a-3p inhibitor干扰载体购于上海吉玛公司。2.利用qRT-PCR方法检测miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞NK92细胞、YT细胞及正常人NK细胞中的表达情况。3.以慢病毒为介导的过表达载体(LV3-miR-148a-3p mimics)、敲除载体(LV3/anti-hsa-miR-148a-3p)分别感染YT细胞、NK92细胞,感染后检测miR-148a-3p的表达情况及YT、NK92细胞增殖能力、细胞迁移能力、细胞侵袭能力、细胞凋亡的影响。*** 21.0软件进行统计学分析。miR-148a-3p的相对表达量三组细胞间均数的比较采用单因素方差分析。得出结果用均值±标准差表示。当P<0.05时,可认为样本间的差异具有统计学意义。所有实验至少重复3-5次。结果***-148a-3p在正常NK细胞、YT细胞、NK92细胞中的相对表达量分别为8.62±0.35、14.55±0.27、24.48±0.44,NK92细胞中的相对表达量显著高于其它两组细胞(P<0.05)。miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞中表达明显升高,NK92细胞表达量约是对照组3倍,YT细胞的表达量约是对照组的1.7倍(P<0.05)。2.用各修饰慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤的YT细胞后,检测敲除组(LV3/anti-hsa-miR-148a-3p)、过表达组(miR-148a-3p)、阴性对照组(LV3-NC)的相对表达量分别是4.84±0.4、21.55±0.33、10.01±0.69,与敲除组、阴性对照组比较,过表达组在YT细胞中表达显著升高(P<0.05)。用各修饰慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤的NK92细胞后,检测敲除组(LV3/anti-hsa-miR-148a-3p)、过表达组(miR-148a-3p)、阴性对照组(LV3-NC)相对表达量分别是8.44±0.3、31.13±0.52、11.11±0.5,与过表达组、对照组比较,敲除组在NK92细胞中表达显著降低(P<0.05)。***-8检测miR-148a-3p对YT、NK92细胞增殖活性的影响,过表达组(miR-148a-3p)与阴性对照组(LV3-NC)比较,过表达组细胞增殖活性明显升高,敲除组(LV3/anti-hsa-miR-148a-3p)与阴性对照组(LV3-NC)比较,敲除组细胞增殖活性明显降低。***小室检测miR-148a-3p对YT、NK92细胞迁移能力的影响。过表达组(miR-148a-3p)与敲除组(LV3/anti-hsa-mi

关键词： 医学遗传学   广州医科大学   细胞生物学   教研室  

摘要： 广州医科大学医学遗传学与细胞生物学教研室创建于20世纪50年代初,原为广州医学院生物学教研室,现有国家卫生和计划生育委员会"十三五"暨全国高等医药教材建设研究会副主编委员1人,广东省医学会医学遗传学分会委员2人,广东省医学会医学遗传学分会青年委员1名,广州医科大学"千百十工程"校级培养对象3人。

关键词： 自噬   CRISPR/Cas9   RhoB  

摘要： 细胞通过自噬清除不需要的大分子物质,为合成过程提供可重复利用的氨基酸、脂肪酸和核苷,在降解再生循环中驱动细胞中的物质流动。激活自噬的信号包括各种应激条件,如饥饿、缺氧、氧化应激、DNA损伤等。有研究发现,在哺乳动物细胞中,能量缺少或活性氧、活性氮处理的情况下,AMPK磷酸化,抑制mTOR活性,激活ULK1,启动自噬过程。Rho家族蛋白RhoB具有重要的生物学功能。本实验室之前的研究发现,在DNA损伤情况下,RhoB被SUMO化修饰并改变其细胞定位,招募TSC复合物聚集于溶酶体上,抑制mTORC1的活性,从而促进自噬的发生。此外,RhoB在蛋白质转运调控、细胞炎症反应调控、血管生成和血管功能调节、肿瘤的发生发展等过程中具有重要作用。在此,本文主要探索在可以激活自噬的各种应激条件下,RhoB蛋白的细胞生物学功能。本文通过CRISPR/Cas9技术特异性敲除人子宫颈癌HeLa细胞中的RhoB基因,获得了RhoB稳定敲除的细胞系。对RhoB稳定敲除细胞系及对照组细胞进行无糖、无血清、无氨基酸、无谷氨酰胺、过氧化氢处理,发现只有在过氧化氢处理时,两组细胞表现出明显的差异。过氧化氢处理时,对照组细胞中mTOR活性被抑制,激活自噬;而敲除RhoB的细胞中mTOR活性受抑制程度明显降低,抑制自噬激活。通过SUMO化实验,发现过氧化氢处理可以增强RhoB的SUMO化修饰,而RhoB蛋白SUMO化修饰是否与过氧化氢引起的自噬有关,还有待于进一步研究。