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关键词： 多点合作式教学   细胞生物学   中医药院校  

摘要： 细胞生物学是一门内容抽象、学习难度较大的专业基础课。本文针对中医药院中医学专业细胞生物学课程开展教学改革,选取2017级中医专业学生为研究对象,随机选择两个班级分为对照组和实验组班级,实验组采用多点合作式教学,对照组采用传统多媒体教学。实验结果发现采用多点合作式教学实验组的学生的学习成果较对照组有明显提升。采用多点合作式教学更有利于提升学生细胞生物学的学习效果,增加学习兴趣,有助于培养学生的科学探索精神。

关键词： 上皮膜蛋白1   PI3K/AKT   胶质瘤   增殖   迁移   CD44  

摘要： 目的:胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤,占颅脑原发性肿瘤的40%～50%,年发病率为3～8人/10万人。2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类重新构建胶质瘤的分型,将分子表型整合组织病理作为诊断标准。这是首次将分子变异纳入诊断金标准,也是癌症领域的一次变革。多形性胶质母细胞瘤((Glioblastomas,GBM))发病率最高,约占星形细胞瘤的75%。其生长速度快,70%～80%未治疗患者病程在3～6个月,病程超过1年者仅10%。当前针对胶质母细胞瘤所采取的疗法,主要包括手术、化疗以及放疗等在内的综合性治疗。但由于肿瘤细胞的高增殖性、高侵袭性,丰富的肿瘤新生血管,导致肿瘤全切困难,易复发,易脑内侵袭和脑脊液播散;同时由于大脑血脑屏障和肿瘤干细胞等因素的存在,肿瘤具备耐放疗和抗化疗的特征,导致GBM患者中位生存期仍只有12-15个月,5年生存期在10%以下。近年来胶质瘤治疗的研究领域有了一些新的发展与突破,包括当前应用最为广泛的分子靶向治疗和正在开展临床试验的免疫治疗、电场疗法(Tumor Treating Fields,TTF)等。其中免疫治疗主要关注于在机体内通过体液免疫和细胞免疫抑制肿瘤细胞的生长;TTF是近年来新兴的胶质瘤治疗手段。由于胶质瘤特殊的肿瘤异质性,分子多靶点的靶向治疗是目前胶质瘤治疗研究的重要方向。研究表明,胶质瘤特别是胶质母细胞瘤对常规治疗方法的耐受性主要是由于高度突变的基因组导致的显著肿瘤异质性。这涉及激活一系列相关信号通路及受体,如酪氨酸激酶受体(TKR)、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、有丝分裂原活化蛋白激酶通道(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶标(MTOR)信号通路等。众所周知,这些信号通路上相关的关键基因调节细胞增殖、血管生成、迁移和侵袭,以及凋亡和自噬,因此,这些信号通路的失调会导致肿瘤的形成、进展、侵袭和对各种治疗方法的耐药性。目前对于这些相关基因变异、信号传导通道的基础研究取得了许多成果并应用于临床,但效果有限。上皮内膜蛋白1基因位于第12染色体p12.3位点,其编码产物上皮内膜蛋白1(Epithelial membrane protein-1,EMP1)对于增加G1期以及缩减S期有着特殊的影响,而且参与具体的肿瘤形成、肿瘤增殖以及分化等多个方面,构成了较为特殊的传导通路。EMP1与一系列生物学活动有关,包括细胞侵袭、增殖、分化和凋亡。多个肿瘤研究中均发现EMP1与肿瘤细胞的侵袭及迁移能力有关。EMP1在不同类型肿瘤中的表达水平有所不同,在部分肿瘤中高表达,而在另一些肿瘤中低表达,对肿瘤的影响也各不相同;在一些实体肿瘤的研究中发现EMP1可以影响PI3K/AKT信号通道。目前EMP1在胶质瘤特别是胶质母细胞瘤的作用及其相关信号通道及机制尚无深入研究。本研究旨在探讨EMP1在胶质瘤中的表达水平及其对预后的影响,使用小干扰RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)下调肿瘤细胞/干细胞中EMP1的表达后对胶质瘤细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其信号传导机制。探索EMP1能否作为胶质瘤分子靶向治疗的潜在靶点。方法:利用癌症基因组图谱(TCGA和CCGA)中的神经胶质瘤细胞及正常脑组织资料,使用GEPIA生物信息学方法分析信息库内胶质母细胞瘤及低级别胶质瘤中EMP1表达水平并与正常脑组织比较。使用RT-qPCR方法检测胶质瘤与正常脑组织样本中EMP1mRNA的水平,Western-blot法检测肿瘤及正常脑组织样本中EMP1蛋白表达的水平,对比胶质瘤与正常脑组织中EMP1表达的差异。设计针对EMP1的siRNA,转染U251和U87胶质瘤细胞,Western-blot法及免疫荧光方法检测转染后细胞内EMP1蛋白表达水平并比较未转染肿瘤细胞中EMP1水平的差异。使用CCK-8方法检测siRNA转染U251和U87胶质瘤细胞的增殖能力,Transwell方法检测转染后肿瘤细胞的侵袭能力,Western-blot法检测转染后肿瘤细胞中CD44和MMP2蛋白表达水平并与未转染肿瘤细胞比较。使用Annexin-V FITC/PI双染法检测siRNA转染U251和U87胶质瘤细胞后肿瘤细胞凋亡能力的变化,与未转染肿瘤细胞比较。构建U87细胞裸鼠荷瘤模型,免疫组化及免疫荧光方法检测荷瘤小鼠肿瘤中Ki-67、MMP2的表达并与对照组比较。Western-blot法、免疫荧光方法检测siRNA转染后U251和U87胶质瘤细胞中PI3K、AKT的磷酸化水平及其下游产物Bcl2和Caspase-3的表达,并与未转染肿瘤细胞比较。胶质瘤细胞系U251培养U251s细胞,Western-blo

关键词： Let-7b   子痫前期   滋养细胞   细胞外调节激酶  

摘要： 目的:子痫前期(pre-eclampsia,PE)是妊娠期特有的疾病,迄今为止,其潜在的发病机制仍未完全阐明。子痫前期病理变化起始于多种因素如胎盘滋养细胞凋亡、自噬过度,侵袭能力降低,导致胎盘“浅着床”和胎盘血管重铸障碍引发PE。微小RNA(microRNA)Let-7b通过对各种细胞炎症、分化、凋亡、自噬及侵袭功能调控参与各类疾病,如炎症、成骨分化及肿瘤等的发生。我们推测Let-7b也可能参与胎盘滋养细胞凋亡、自噬、EMT及侵袭等各项功能调控参与PE发生。方法:***-7b在PE胎盘及PE滋养细胞模型中的表达1.1使用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测Let-7b在PE滋养细胞模型和对照组中的表达变化。1.2 qRT-PCR检测Let-7b在21个PE和19个正常妊娠组胎盘组织中的表达变化。1.3 westernblot检测PE胎盘和PE滋养细胞模型中细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)表达水平。***-7b对滋养细胞生物学功能影响选择细胞滋养细胞模型HTR-8/SVneo,构建了Let-7b过表达的滋养细胞及对应的阴性对照,qRT-PCR检测Let-7b表达变化。2.1使用CCK8、EdU实验来检测Let-7b对滋养细胞增殖的影响。2.2使用流式细胞术、Annexin V/DAPI染色检测Let-7b对滋养细胞凋亡情况的变化;Western blot方法检测凋亡蛋白caspase3表达变化。2.3使用Western blot法检测Let-7b对滋养细胞自噬蛋白LC3B表达变化,qRT-PCR法检测自噬相关基因Atg7、Atg4B和beclin改变。2.4使用qRT-PCR法检测Let-7b对滋养细胞TNF-α,IL-6和IL-10免疫炎性细胞因子的变化情况。2.5使用Western blot实验检测过表达Let-7b后对细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transi-tion,EMT)E-cadherin和Vimentin蛋白表达变化。使用Transwell检测过表达Let-7b后对细胞侵袭能力的改变。***-7b对滋养细胞EMT过程及侵袭机制的研究3.1 Let-7b对ERK通路激活/抑制的验证及与通路相关的EMT与侵袭机制选择细胞滋养细胞模型HTR-8/SVneo,构建了Let-7b过表达的滋养细胞及对应的阴性对照,使用Western blot法检测过表达Let-7b后对ERK通路蛋白变化的影响。通过使用ERK信号通路抑制剂U-0126阻断过表达Let-7b组及对应阴性对照组ERK的活化,Western blot及Transwell实验检测滋养细胞EMT及侵袭功能的变化。3.2 Let-7b下游靶基因的筛选与验证通过对Targetscan,miRBase等生物信息学网站分析,挑选与所研究Let-7b具有碱基互补的TGFBR1。对Let-7b过表达的滋养细胞及对应的阴性对照分别检测TGFBR1蛋白水平变化。3.3 Let-7b通过对下游TGFBR1的调控调节ERK通路的机制研究回复实验检测Let-7b对TGFBR1的调控及Let-7b通过下游TGFBR1调控ERK通路及对滋养细胞侵袭功能的影响。结果:1.在PE滋养细胞模型中,Let-7b的表达较正常对照组明显下调。PE胎盘组织中Let-7b表达显著低于正常妊娠组。同时发现,PE滋养细胞模型和PE胎盘ERK通路蛋白的表达均明显降低。2.体外实验验证发现,Let-7b可以明显促进滋养细胞增殖、EMT过程及侵袭功能,并降低其凋亡、自噬能力。同时发现,Let-7b可降低细胞中TNF-α的表达,同时增加IL-6的产生。***-7b可以激活ERK信号通路,并可以通过ERK信号通路进而促进滋养细胞的EMT及侵袭功能。通过生物信息学方法分析预测及实验验证发现,Let-7b与TGFBR1 mRNA 3'-UTR区特异性结合并且负向调控TGFBR1蛋白水平表达。内源性过表达Let-7b可激活ERK通路参与滋养细胞侵袭,并且这种激活作用是通过下游TGFBR1介导进而实现的。结论:通过研究发现,PE滋养细胞模型Let-7b表达下降,并通过调控滋养细胞EMT和侵袭功能,以及增殖、凋亡、自噬、炎症反应等过程参与PE的发病。Let-7b/TGFBR1/ERK调控通路可能参与临床PE的发生发展,为PE的治疗奠定了理论基础。

关键词： 牙周膜干细胞   外周血单个核细胞   成骨分化   免疫调节   衰老  

摘要： 研究目的:牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）在干细胞治疗,组织工程与再生领域中广泛应用。但是年龄对人牙周膜干细胞的生物学和免疫学特性的作用影响尚待明确。研究方法:1.根据患者年龄分为年轻组（19-20岁）及年老组（35-50岁）,采用组织块法体外分离培养不同年龄组的牙周膜干细胞。2.检测两组牙周膜干细胞生物学特性的差异:通过流式细胞术比较两组牙周膜干细胞的表面分子（Stro-1,CD146,CD31和CD45）表达的差异;通过CCK-8及EdU染色法比较两组牙周膜干细胞增殖能力的差异;通过Annexin V-PE/7-ADD染色比较两组牙周膜干细胞凋亡能力的差异;将两组牙周膜干细胞同期行成骨及成脂诱导,7天后进行碱性磷酸酶染色及活性定量测定,21天后进行茜素红染色及定量测定,14天后进行油红O染色及定量测定,以比较两组牙周膜干细胞的成骨及成脂分化潜能的差异。3.检测两组牙周膜干细胞免疫学特性的差异:通过流式细胞术比较两组牙周膜干细胞的表面分子（HLA-Ⅰ,HLA-Ⅱ DR,CD80和CD86）表达的差异;将两组牙周膜干细胞分别与异体的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）共培养,并通过五种不同的共培养方式,用EdU染色法比较分别与两组牙周膜干细胞共培养过的外周血单个核细胞增殖能力的差异;通过Annexin V-PE/7-ADD染色比较分别与两组牙周膜干细胞共培养过的外周血单个核细胞凋亡水平的差异。4.探究两组牙周膜干细胞生物学及免疫学特性差异的潜在机制:通过基因芯片技术比较两组牙周膜干细胞中差异表达的基因,并通过qRT-PCR及Western-blot技术验证两组牙周膜干细胞中的高差异表达的基因和蛋白。研究结果:1.成功分离培养两组牙周膜干细胞,分为年轻组（YPDLSCs）及年老组（APDLSCs）。***的生物学特性较YPDLSCs明显变弱:APDLSCs中Stro-1和CD146的阳性表达率均低于YPDLSCs;APDLSCs的增殖能力明显弱于YPDLSCs;APDLSCs的凋亡水平较YPDLSCs明显升高;成骨诱导7天后,APDLSCs的碱性磷酸酶活性较YPDLSCs显著降低,成骨诱导21天后,APDLSCs的的矿化结节生成量较YPDLSCs明显减少,成脂诱导14天后,APDLSCs的脂滴形成数量及大小较YPDLSCs明显变少,即APDLSCs成骨及成脂分化潜能明显弱于YPDLSCs。*** 的免疫学特性较 YPDLSCs 明显变弱:HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ DR、CD80和CD86的表达率在APDLSCs与YPDLSCs中无统计学差异,APDLSCs与YPDLSCs均表达低免疫原性;APDLSCs与YPDLSCs均能抑制异体外周血单个核细胞的增殖,但APDLSCs的免疫抑制能力弱于YPDLSCs;分别与APDLSCs和YPDLSCs共培养过的外周血单个核细胞的凋亡水平无统计学差异。4.基因芯片结果显示,APDLSCs与YPDLSCs相比,免疫相关基因（CCND3和RC3H2）的mRNA表达上调,成骨相关基因（Runx2,ALP,COL1A1）、成脂相关基因（PPARγ2）、以及其他免疫相关基因（CXCL12,FKBP1A,FKBP1B,NCSTN,P2RX7,PPP3CB,RIPK2,SLC11A1 和 TP53）的 mRNA表达下调。qRT-PCR及Western-blot检测证实了 APDLSCs与YPDLSCs相比,成骨及成脂相关基因和蛋白（RUNX2,ALP,COL1A1和PPARγ2）的表达水平明显降低,免疫相关基因和蛋白（CCND3）的表达水平增高最为显著。结论:年龄对牙周膜干细胞的生物学和免疫学特征具有重要影响,年轻组牙周膜干细胞的增殖能力、多向分化潜能及免疫抑制能力明显优于年老组牙周膜干细胞。这项实验结论提示我们在用牙周膜干细胞治疗牙周炎或牙齿再生时,应尽量选择来自年轻个体的牙周膜干细胞。除此之外,我们应注意年轻个体的牙周膜干细胞的储存,以供衰老后有临床治疗需要时使用,或供其他需要牙周膜干细胞异体移植的老年人使用。

ISBN: (纸本)9787040471571

关键词： B3GALT2   前列腺癌   增殖   迁移   生物信息学  

摘要： 背景:前列腺癌在男性人群中是一种高发的恶性肿瘤,其危害性非常大。近些年来,随着医疗水平和科技发展水平不断提高,使前列腺癌的检出率明显上升,而且随着人均寿命的延长,前列腺癌的诊断率越来越高患,特别是早期前列腺癌患者诊断率明显提高。不过整体来看,我国晚期前列腺癌患者的数量仍然远高于早期筛查出的前列腺癌患者。目前前列腺癌的治疗方案包括内分泌治疗、腹腔镜下前列腺癌切除术以及机器人腹腔镜前列腺癌切除术等,这些疗法可以使早期前列腺癌得到有效的治疗。然而晚期前列腺癌,特别是前列腺癌出现骨转移的患者。在经历2-3年的内分泌治疗后,大多会转化成去势抵抗性前列腺癌（castration resistant prostate cancer,CRPC）。CRPC没有较好的治疗方案,CRPC患者的预后一般较差。因此研究前列腺癌的进展机制非常有意义。我们前期发现的一个基因B3GALT2很有可能在前列腺癌的进展过程中起着重要作用,然而,B3GALT2在前列腺癌中的表达情况,以及其在前列腺癌中的作用仍然未见报道。B3GALT2是beta-1,3-半乳糖基转移酶（beta3GalT）基因家族的成员。该家族能够使用不同类型的供体底物（UDP-半乳糖和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖）和不同种类的受体糖（N-乙酰氨基葡萄糖,半乳糖,N-乙酰半乳糖胺）编码具有多种酶功能的Ⅱ型膜结合糖蛋白。该基因在N-连接的糖蛋白的糖基化中起作用,并显示出对UDP-半乳糖严格的底物特异性。然而,B3GALT2在前列腺癌中的表达情况,以及其在肿瘤中的作用机制仍然未见报道。在本研究中,我们使用生物信息学方法分析B3GALT2在前列腺癌中的表达情况及其功能,并结合分子生物学方法对其进行验证,为进一步揭示B3GALT2在前列腺癌中的作用机制,并将其作为新的分子靶标为前列腺癌的诊断治疗提供新的依据。目的:应用生物信息学分析方法探究B3GALT2在正常前列腺及前列腺癌组织之间的表达差异,并研究B3GALT2对前列腺癌患者的生存期的影响。为前列腺癌研究提供新的思路。方法:1.下载TCGA数据集中的前列腺癌项目,通过对项目数据进行分析,研究B3GALT2在前列腺癌中的表达情况以及B3GALT2表达对生存期的影响。2.应用qRT-PCR,WB检测B3GALT2在前列腺增生细胞系BPH1和前列腺癌细胞系LNcaP和PC3中mRNA和蛋白的表达情况。3.在前列腺癌细胞系LNcaP中敲降和过表达的细胞B3GALT2后,应用CCK8检测前列腺癌细胞增殖的能力、应用前列腺癌细胞划痕实验方法检测细胞迁移的能力、应用流式细胞术方法检测细胞周期变化,证明B3GALT2在治疗前列腺癌中发挥的重要抑癌能力和基因组的抑制作用。研究结果:1.生物信息学数据显示B3GALT2在正常前列腺癌组织中的表达水平显著高于在前列腺癌组织中的表达水平。2.B3GALT2低表达的前列腺癌患者无进展生存期预后较差。3.B3GALT2的RNA表达水平在BPH1、LNCaP和PC3细胞系中的表达水平依次降低,在蛋白水平,B3GALT2蛋白的表达与RNA的表达情况一致,在BPH1、LNCaP和PC3中的表达水平依次降低。4.通过qRT-PCR和Western Blot的方法证明了在转染siB3GALT2后,LNCaP细胞中的B3GALT2 RNA和蛋白的表达量显著降低。同样,在转染B3GALT2的过表达质粒后,LNCaP细胞中的B3GALT2 RNA和蛋白的表达量显著升高。***8实验表明B3GALT2具有抑制前列腺癌细胞生长的作用。6.划痕实验进一步证实了 B3GALT2能够有效地抑制恶性前列腺癌细胞的迁移抑制能力。7.流式细胞术用于检测细胞周期的实验结果显示证实B3GALT2细胞能够有效地起到对阻滞细胞周期的抑制作用。8.通过GO分析以及对细胞表达相关性的分析,我们可以发现B3GALT2可能是通过 GNL3,TRAF4,HNRNPL,PTBP1,CDK16,LETM1,RUVBL1 等基因起作用的。结论:1.本课题通过PCR,流式细胞学,Western blot,cck8等的研究检测方法发现B3GALT2在LNcap细胞中低表达,并且其低表达促进LNCaP细胞增殖。2.同时,在LNcap细胞中敲除和过表达B3GALT2,发现B3GALT2高表达抑制前列腺癌细胞的迁移能力。3.B3GALT2对前列腺癌的研究提供可能的探索方法。

关键词： 肝细胞癌   miR-206   TIGIT   CD155   siRNA靶向治疗   T细胞   TIGIT   CD226   趋化因子受体   T细胞凋亡  

摘要： 肝细胞癌(HCC)是最常见的肝脏恶性肿瘤,约占原发性肝癌的85%,是全球与癌症死亡相关的第六大常见肿瘤。据统计,每年新增病例约84.1万人,其中我国每年的发病率约占世界总数的一半。肝细胞癌的发生是多种因素共同作用的结果。因此,探讨肝细胞癌发生发展过程中复杂的生物学机制有重大意义,以期能为肝细胞癌的诊治提供新的理论依据和实验数据。TIGIT是近年来新发现的一种负性共刺激分子,在参与诱导T细胞免疫耐受和肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用,TIGIT主要表达于活化的免疫细胞表面,鲜有报道其表达于肿瘤细胞表面;CD155(PVR)是免疫球蛋白超家族成员之一,是与TIGIT结合亲和力最好的配体之一,主要表达于抗原提呈细胞或肿瘤细胞表面,与TIGIT相互作用后能够抑制宿主细胞的免疫应答,导致肿瘤微环境中的免疫细胞发生“衰竭”。本课题旨在探讨TIGIT-CD155通路对肝癌细胞和免疫细胞的生物学功能的影响,同时探讨了肝细胞癌患者外周血TIGIT+T细胞的表型及功能变化。第一部分TIGIT-CD155通路调控肝癌细胞、免疫细胞生物学功能的研究目的明确TIGIT、CD155调控肝癌细胞、免疫细胞生物学功能的机制。方法设计、构建靶向TIGIT、CD155的mi R-206、TIGIT si RNA和CD155si RNA,通过体内、外试验探究TIGIT、CD155调控肝癌细胞、免疫细胞生物学功能的机制。1.利用本研究室已构建成功的靶向TIGIT的mi R-206慢病毒载体感染肝癌细胞Hep G2、Hep G2.215、SMMC-7721和Bel-7402细胞,利用CCK-8实验检测肝癌细胞体外增殖能力,划痕实验检测肝癌细胞体外迁移能力,Transwell实验检测肝癌细胞体外迁移、侵袭能力,流式细胞术检测肝癌细胞体外凋亡能力,Western blot检测肝癌细胞中TIGIT及与肿瘤迁移侵袭相关蛋白MMP-9、凋亡相关蛋白BAX和Bcl-2的表达水平,采用裸鼠皮下成瘤实验观察肝癌细胞SMMC-7721裸鼠皮下成瘤的情况,免疫组化和Western blot检测裸鼠瘤体组织中TIGIT的表达情况来验证靶向TIGIT的mi R-206能否有效抑制肿瘤的发生和发展;2.利用mi R-206慢病毒载体感染构建成功的TIGIT过表达Jurkat T(OE)细胞,CCK-8实验检测Jurkat T(OE)细胞增殖能力的改变,Western blot检测Jurkat T(OE)细胞TIGIT及与凋亡相关蛋白BAX和Bcl-2的表达情况;3.利用Western blot检测肝癌细胞Hep G2、Hep G2.215、SMMC-7721和Bel-7402细胞中TIGIT的表达情况,设计TIGIT的si RNA,通过转染试剂将其转染至肝癌细胞,利用CCK-8实验检测肝癌细胞体外增殖能力,划痕实验检测肝癌细胞体外迁移能力,Transwell实验检测肝癌细胞体外迁移、侵袭能力,流式细胞术检测肝癌细胞体外凋亡能力,Western blot检测肝癌细胞中TIGIT及与肿瘤迁移侵袭相关蛋白MMP-9、凋亡相关蛋白BAX和Bcl-2的表达水平,采用裸鼠皮下成瘤实验,观察TIGIT si RNA对肝癌细胞SMMC-7721裸鼠皮下成瘤的情况,免疫组化和Western blot检测裸鼠瘤体组织中TIGIT的表达情况,来验证靶向TIGIT的si RNA能否有效抑制肿瘤的发生和发展;4.利用Western blot检测肝癌细胞Hep G2、SMMC-7721和Bel-7402细胞中CD155的表达情况,设计CD155的si RNA,通过转染试剂将其转染至肝癌细胞,CCK-8实验检测肝癌细胞体外增殖能力,流式细胞术检测肝癌细胞体外凋亡能力,Western blot检测肝癌细胞CD155及与肿瘤迁移侵袭相关蛋白MMP-2、FAK和SRC、凋亡相关蛋白BAX和Bcl-2表达情况,采用裸鼠皮下成瘤实验,观察CD155 si RNA对肝癌细胞SMMC-7721裸鼠皮下成瘤的影响,免疫组化和Western blot检测裸鼠瘤体组织中CD155的表达情况,来验证靶向CD155的si RNA能否有效抑制肿瘤的发生和发展。结果*** R-206慢病毒载体感染肝癌细胞Hep G2、Hep G2.215、SMMC-7721和Bel-7402细胞后,CCK-8实验结果显示:与NC组相比,mi R-206能抑制肝癌细胞体外的增殖能力,有统计学差异(P<0.05),划痕实验、Transwell实验结果显示:与NC组相比,mi R-206能抑制肝癌细胞体外的迁移和侵袭能力,有统计学差异(P<0.05),流式细胞术结果显示:与NC组相比,mi R-206能促进肝癌细胞的凋亡,有统计学差异(P<0.05),Western blot

关键词： RALY   非小细胞肺癌   增殖   细胞周期   上皮-间质转化  

摘要： 目的:肺癌是所有肿瘤中发病率和致死率最高的恶性肿瘤,严重威胁人类的生命。随着经济的快速发展及环境的污染,肺癌的发病率也在逐年升高。其主要包括小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)两种不同的病理类型。其中患病人数较多的NSCLC约占肺癌的85%。近年来肺癌的发病率逐年升高,但患者预后并无明显改善。因此寻找肺癌新的治疗靶点尤为重要。RALY是核内不均一核糖核蛋白家族(Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein,hnRNP)的一员,是一种RNA结合蛋白,在m RNA剪接与代谢等方面发挥作用。近些年,越来越多的研究表明RALY在多系统肿瘤中发挥促癌作用,但其在NSCLC中的生物学功能及分子机制仍然未知。本研究旨在探讨RALY在NSCLC中的表达,分析其与NSCLC临床病理学特征的关系及对预后的影响。探索RALY对NSCLC细胞增殖、周期、迁移及侵袭等生物学功能的影响及分子机制。为研究NSCLC的发生、发展机制及靶向治疗提供新靶点。方法:经癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)下载1020例NSCLC组织样本及108例正常肺组织样本中RALY mRNA表达的数据,进行差异表达分析。应用免疫组化法检测80例NSCLC癌组织及25例癌旁组织中RALY的蛋白表达水平,并分析其与临床病理特征及预后的关系。应用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹试验(Western blot)检测人正常支气管上皮细胞16HBE、肺鳞癌细胞SK-MES-1及肺腺癌细胞A549中RALY mRNA和蛋白的表达水平。使用慢病毒稳定转染,沉默SK-MES-1和A549细胞中的RALY,对处理后的细胞行CCK8实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验及流式细胞术,并检测细胞周期相关指标(c-Myc,Cyclin D1,CDK 4,P27)、细胞转移相关指标(MMP9,Rho A,Rho B,Rho C)及上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关指标(N-cadherin,E-cadherin,β-catenin)表达差异。使用慢病毒转染,对沉默RALY的A549稳转细胞株重新引入RALY序列以进行挽救实验,观察挽救后的A549细胞增殖、迁移及侵袭能力变化。结果:检索TCGA数据库结果显示,与正常肺组织相比,RALY mRNA在NSCLC患者癌组织中高表达。免疫组化结果显示,与NSCLC患者的癌旁组织相比,RALY蛋白在癌组织中高表达,其表达水平与淋巴结转移(P=0.007)相关。单因素分析结果表明淋巴结转移阳性(P=0.029)、临床分期Ⅲ期(P=0.001)及RALY高表达(P=0.047)是影响NSCLC总生存的不良预后因素;多因素分析结果表明临床分期(P=0.008)是影响NSCLC总生存的独立预后因素。生存分析结果显示RALY高表达的患者预后较差(P=0.042)。与正常支气管上皮细胞16HBE相比,肺鳞癌细胞SK-MES-1和肺腺癌细胞A549中RALY m RNA和蛋白表达水平均升高(P<0.05)。与阴性对照组相比,沉默RALY抑制SK-MES-1和A549细胞的增殖、迁移及侵袭能力,参与调节EMT进程,使细胞阻滞在G1期,且RALY的重新引入挽救了A549细胞的增殖、迁移及侵袭等生物学表型。沉默RALY可下调c-Myc、Cyclin D1、CDK4、MMP9、Rho A、Rho C、N-cadherin和β-catenin的表达水平,上调了Rho B、P27及E-cadherin的表达水平。结论:RALY在NSCLC中高表达,与淋巴结转移相关,其高表达的NSCLC患者预后差;RALY促进NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭能力,参与调节细胞周期及EMT过程,影响相关下游指标表达水平。

关键词： 细胞生物学   多元化   教学方法  

摘要： 作为生命科学的枢纽学科和前沿学科,细胞生物学的教学效果对于生物学方向的学生后期专业学习及科学研究具有重要的意义。然而,细胞生物学课程知识点多、实验性强,单纯的讲授法容易使学生学习兴趣降低、教学质量低。因此,我们根据教学内容和教学进度,不断探索多元化教学方法,取得良好效果。

关键词： 乳腺癌   MCF7   STAT1   基因沉默技术  

摘要： 背景:乳腺癌是世界上最常见及死亡率最高的女性肿瘤之一,美国预计2020年将有276480例乳腺癌新确诊病例,占女性新确诊癌症病例的30%,严重影响了女性病人的身心健康。由于治疗水平的重大进展,乳腺癌的相关死亡已经减少,手术治疗、放化疗、激素治疗及靶向治疗是目前癌症治疗的成熟策略。因此,阐明肿瘤发生发展的分子机制,识别新的治疗靶点及预后生物标志物是很有必要的。STAT1定位于人类染色体2q32.2,由750个氨基酸残基组成,分子量为91kDa,是第一个被发现的信号转导与转录激活因子家族(signal transducer and activator of transcription,STAT)的成员,STAT1常被认为具有抑制肿瘤的功能,其主要作用是诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡和抑制肿瘤细胞的转移。本课题组前期实验发现STAT1在乳腺癌组织中高表达,并通过构建STAT1基因低表达的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,证实了STAT1基因在MDA-MB-231细胞中发挥抑癌作用。目的:本研究通过构建STAT1基因沉默的乳腺癌细胞株MCF7,并观察其对乳腺癌细胞MCF7细胞生物学功能的影响,初步探讨该基因在乳腺癌发展中的作用机制,并为临床治疗乳腺癌寻找新的作用靶点。方法:1.由广州复能基因有限公司负责构建STAT1基因沉默质粒,用STAT1基因沉默质粒psi-LVRU6MP-STAT1和包装质粒PMD2.G、PRSV-Rev、PMDLg/PRRE共同转染293T细胞,获得psi-LVRU6MP-STAT1-shRNA1、2、3、4及阴性对照组的慢病毒毒液。2.用psi-LVRU6MP-STAT1-shRNA1、2、3、4及阴性对照组的慢病毒毒液分别感染乳腺癌细胞MCF7,用嘌呤霉素筛选成功感染的乳腺癌细胞MCF7,获得四组STAT1基因沉默乳腺癌细胞株,分别是STAT1-shRNA1、STAT1-shRNA2、STAT1-shRNA3、STAT1-shRNA4以及用空载体慢病毒感染的阴性对照组乳腺癌细胞株MCF7。对STAT1-shRNA1、STAT1-shRNA2、STAT1-shRNA3、STAT1-shRNA4和用空载体慢病毒感染的阴性对照组乳腺癌细胞MCF7中的STAT1基因进行实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测。3.以MCF7细胞作为空白对照组(Normal、N),转染空载体慢病毒的MCF7细胞为阴性对照组(Negative Control、NC),沉默效果最好的STAT1-shRNA3为阳性对照组,对以上3组细胞进行细胞功能试验。通过细胞增殖实验(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测细胞增殖率的变化,通过划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力的变化,通过Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化,通过流式细胞学技术检测细胞周期及凋亡率的变化。4.通过统计学软件SPSS24.0对我们的原始数据进行处理并分析,对于符合正态分布的计量资料用均数±标准差(x±s)来表示。两样本均数的比较采用T检验,多样本均数比较(三组及三组以上)采用单因素方差分析(one-way ANOVA),检验水准为0.05,P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.成功构建了沉默STAT1基因的乳腺癌细胞株STAT1-shRNA1、STAT1-shRNA2、STAT1-shRNA3、STAT1-shRNA4以及用空载体慢病毒感染的阴性对照组(Negative Control、NC)乳腺癌细胞MCF7。经过qRT-PCR技术检测慢病毒感染后的乳腺癌细胞株MCF7中STAT1 mRNA的表达水平,结果显示:MCF7阴性对照组、STAT1-shRNA1、STAT1-shRNA2、STAT1-shRNA3及STAT1-shRNA4的STAT1 mRNA相对表达量分别是:1、1.76、0.99、0.11、0.80,发现STAT1-shRNA3的沉默效果最好,沉默效率达89%,因此后续选用STAT1-shRNA3组乳腺癌细胞MCF7作为阳性对照组进行后续的细胞功能实验。2.细胞增殖实验结果显示:沉默组乳腺癌细胞STAT1-shRNA3在12小时、24小时、36小时及48小时检测到的OD值均明显高于阴性对照组乳腺癌细胞MCF7的OD值,并且差异有统计学意义(p<0.05)。沉默组乳腺癌细胞STAT1-shRNA3在12小时、24小时、36小时及48小时的增殖率均高于阴性对照组及空白对照组乳腺癌细胞MCF7的增殖率,差异具有统计学意义(p<0.01),说明沉默STAT1基因促进了乳腺癌细胞MCF7的增殖能力。划痕实验