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关键词： 蔓荆子黄素   肺癌   H322细胞   生物学效应  

摘要： 目的：该实验采用蔓荆子黄素药液作用于人肺癌H322细胞，探讨蔓荆子黄素抑制人肺癌H322细胞增殖的作用机制，从而为蔓荆子黄素在临床上治疗肺癌提供理论依据。　　方法：采用不同浓度的蔓荆子黄素药液做用于人肺癌H322细胞，并设置1640培养基培养人肺癌H322细胞作为空白对照组。　　(1)应用MTT法检测细胞抑制率，并绘制曲线图，选取蔓荆子黄素最佳的作用浓度及时间;(2)通过划痕实验检测蔓荆子黄素对人肺癌H322细胞迁移能力的影响;(3)用流式细胞仪检测蔓荆子黄素各浓度组对H322细胞周期的影响;(4)用流式细胞仪检测蔓荆子黄素各浓度组对H322细胞凋亡的影响;(5)采用Western-Blot法检测相关周期蛋白CDK1的表达;原癌基因c-myc的表达;具有调控细胞周期和细胞凋亡的双重功能Survivin蛋白的表达。　　结果：MTT结果表明：蔓荆子黄素药液可以有效抑制人肺癌H322细胞的增值，并且呈药物浓度依赖性;与空表组相比较，浓度为1umol/L、10umol/L、20umol/L、40umol/L时蔓荆子黄素药液组48h的抑制率分别是：27.46%、27.46%、44.29%、60.32%，蔓荆子黄素药液与空白组对照组比较有显著差异(p＜0.05)。　　细胞划痕实验结果表明：蔓荆子黄素药液可以有效抑制人肺癌H322细胞迁移，随着药物浓度的增高，划痕愈合率随之降低，而空白对照组愈合能力最强，蔓荆子黄素与空白组比较具有显著性差异(p＜0.05)，表明蔓荆子黄素药液能够抑制人肺癌H322细胞迁移;流式细胞周期结果表明：蔓荆子黄素药液对人肺癌H322细胞在G2/M期发生阻滞，与空白对照组相比较，浓度为1umol/L、10umol/L、20umol/L、40umol/L时，G2/M期积累的百分比依次为8.65%、8.96%、10.18%、14.48%，蔓荆子黄素组与空白对照组比较有明显差异(p＜0.05)。　　流式细胞凋亡结果表明：蔓荆子黄素药液对人肺癌H322细胞具有明显的诱导凋亡作用，空白组、1umol/L、10umol/L、20umol/L、40umol/L的蔓荆子黄素药液组48h的凋亡率分别是：5.1%、6.9%、7.2%、10.2%、12.7%，蔓荆子黄素药液与空白对照组比较有明显差异(p＜0.05)　　Western-Blot结果表明：在蔓荆子黄素药液作用48h后，用Westernblot方法检测H322细胞对c-myc蛋白、CDK1、survivin这三种蛋白表达的影响。结果显示：随着蔓荆子黄素浓度的的升高，细胞中c-myc蛋白、survivin蛋白表达降低;CDK1蛋白表达先上升后下降，提示蔓荆子黄素药液通过下调c-myc、survivin蛋白和先上调后下调CDK1蛋白的表达诱导人肺癌H322细胞凋亡。　　结论：蔓荆子黄素药液对人肺癌H322细胞的增值具有明显的抑制作用;蔓荆子黄素药液可以抑制人肺癌H322细胞的迁移;蔓荆子黄素药液作用于人肺癌H322细胞，使得细胞周期阻滞在G2/M期;蔓荆子黄素药液通过下调c-myc、survivin蛋白的表达诱导人肺癌H322细胞凋亡;蔓荆子黄素药液通过下调c-myc、survivin蛋白，先上调后下调CDK1蛋白的表达诱导人肺癌H322细胞凋亡。

关键词： 线上教学   细胞生物学与遗传学  

摘要： 在这个特殊的寒假期间各高校根据教育部"停课不停教,停课不停学"的要求,积极开展在线教学。在线教学不受时空限制,但缺乏"临场感"和"真实感"。如何发挥在线教学的优势,避免劣势,值得探索。本院细胞生物学与遗传学在线课程通过丰富教学资源,拓展了教和学的时间和空间;在线实施"以学生为中心"的教育理念,提高学习的积极性和主动性;创新评价模式,强化学生学习效率。课前加强预习和自学,并检查学生的完成度。课中针对难点展开讨论并检测自学内容,提高学习的效率。课后利用作业增加学生的知识掌握程度,如通过病例分析提高学生对所学知识的情景应用能力。以上方法有力推动了我校细胞生物学与遗传学在线教学质量提高。

关键词： 脱落乳牙牙髓干细胞   外泌体   成骨分化   条件培养基   骨再生  

摘要： 目的:外泌体是细胞分泌的纳米级细胞外囊泡,是细胞间遗传物质传递的新载体,其在肿瘤标志物、癌症治疗、以及组织再生等多种病理和生理过程中起到了关键作用。脱落乳牙牙髓干细胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)是一种具有高增殖、多潜能分化能力且容易获得的干细胞,其来源的细胞外囊泡如外泌体研究较少。因此,本研究利用人脱落乳牙牙髓干细胞来源的外泌体(SHED-Exos)探究其在牙周炎小鼠体内的成骨效果和调节骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外成骨分化能力,为脱落乳牙牙髓干细胞来源的外泌体促进骨再生提供研究参考。方法:1.外泌体收集:SHED培养至第4-7代,收集细胞培养液,采用30%蔗糖垫超速离心法提取SHED-Exos,使用透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)观察SHED-Exos的形态特征,利用蛋白质印迹法(Western blot)对表面标记物CD63进行鉴定;***培养及生物学特性检测(1)骨髓间充质原代细胞取自10月龄小鼠股骨和胫骨,传代到第1代和第2代(P1-P2),观察细胞形态及多向分化能力;(2)将BMSCs与磷酸盐缓冲液(Phosphate balanced solution,PBS)、SHED-Exos(1μg/ml)和SHED-CM(Conditional medium,CM)共培养,利用细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8,CCK-8)检测各处理组BMSCs增殖能力。我们利用5μM喜树碱诱导BMSCs细胞凋亡,通过不同处理、利用流式细胞术检测细胞凋亡变化;(3)为了检测BMSCs成骨水平的情况,将PBS、SHED-Exos、SHED-CM分别加入成骨诱导培养基中培养BMSCs,成骨诱导3天后,通过实时荧光定量反转录聚合酶链反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测ALP、Runx2成骨基因表达;成骨诱导7天,利用对硝基苯基磷酸酯溶液(p-Nitrophenyl Phosphate,p-NPP)检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性;成骨诱导14天,通过q RT-PCR检测Runx2、Osx成骨基因表达,茜素红染色观察矿化结节形成,并使用氯化十六烷基吡啶溶液进行定量,利用Western blot检测Runx2蛋白翻译水平差异;(4)将PBS、SHED-Exos、SHED-CM分别加入成脂诱导培养基中,再通过q RT-PCR检测成脂基因过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)的表达水平情况;显微镜下观察不同处理组脂滴生成差异并进行定量分析;(5)利用1μg/ml脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激BMSCs 24小时,以诱导促炎症相关基因的表达。同时加入PBS、SHED-Exos(10μg/ml或1μg/ml)、SHED-CM与BMSCs共培养24小时,通过q RTPCR检测促炎症因子白介素6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平差异。3.牙周炎模型建立:选取10月龄小鼠,在小鼠上颌第一磨牙周围利用5-0丝线进行牙周结扎,14天后去除结扎线,同期在第一磨牙牙周颊、腭侧局部注射PBS或SHED或SHED-Exos,每周注射一次,两周后对小鼠上颌进行取材,通过微计算机断层扫描技术(Micro computed tomography,Micro CT)扫描,进行3D重建,分析第一磨牙颊、腭侧骨再生情况,并测定近、远中釉牙骨质界(Cementum-enamel junction,CEJ)到牙槽骨嵴顶(Alveolar bone crest,ABC)距离,通过组织学切片,进行HE和Masson染色观察新生骨质情况;结果:***细胞培养至P4-P7代,细胞呈大小均匀的长梭形或纺锤状形态,利用超高速离心法提取的SHED-Exos,使用TEM观察提取的外泌体为直径100nm左右的球状膜包裹结构,Western blot显示CD63表达阳性;2.为了进一步探寻外泌体对于骨髓间充质干细胞/基质细胞的生物学调控作用,我们从10月龄小鼠胫骨和股骨骨髓内分离并培养骨髓来源间充质干细胞。培养至P1-P2代的细胞呈梭形并且可向成骨成脂方向分化,用于后续实验。SHED-Exos可促进BMSCs增殖,无明显抑制早期凋

关键词： 子宫内膜癌Ishikawa细胞   PP2A   OA   DES   细胞生物学功能  

摘要： 目的:探讨蛋白磷酸酶2A(PP2A)特异性抑制剂冈田酸(OA)及激动剂D-赤型神经胺(DES)作用于人子宫内膜癌细胞系(Ishikawa细胞),其对细胞水平PP2A表达情况及细胞功能的影响。方法:1.常规培养Ishikawa细胞,取对数生长期的细胞,使用PP2A激动剂(DES浓度分别为0nmol/l,5nmol/l,10nmol/l,20nmol/l)及PP2A抑制剂(OA浓度分别为0nmol/l,10nmol/l,20nmol/l,40nmol/l)分别处理12h、24h,48h后,加入CCK8溶液检测OA及DES对细胞的增殖及抑制情况;2.进一步选取其中对Ishikawa细胞增殖率和抑制率最明显的浓度和时间点作为实验组,并设置对照组,其中选择DES的浓度为20nmol/l,选择OA的浓度为40nmol/l,于48h行划痕试验检测细胞的迁移能力,Treanswell试验检测细胞的侵袭能力,流式细胞学测细胞周期,Western Blot法检测细胞水平PP2A的表达变化情况。结果:***总体上显示出了对Ishikswa细胞的抑制作用;行两两比较,发现随着浓度和时间的增加,其抑制率显示出了时间-剂量依赖性;其中以DES浓度为20nM、时间为48h时,其抑制作用最明显。OA总体上显示出了对Ishikswa细胞的促增殖作用,行两两比较,随着时间和浓度的增加,其增殖率显示出了时间-剂量依赖性;其中以OA浓度为40nM、时间为48h时,其增殖作用最明显。2.浓度为40nmol/l的OA及20nmol/l的DES作用于Ishikawa细胞48h时,划痕试验显示:与对照组相比,OA能明显促进细胞迁移,DES能明显抑制细胞的迁移,差异均有统计学意义。Treanswell试验显示:与对照组相比,OA为能明显促进细胞侵袭,DES能明显抑制细胞的侵袭,差异均有统计学意义。3.浓度为40nmol/l的OA及20nmol/l的DES作用于Ishikawa细胞48h时,流式细胞学周期试验显示:OA组细胞的增殖活力较对照组增强,差异有统计学意义,DES组细胞的增殖活力较对照组下降,差异有统计学意义;4.浓度为40nmol/l的OA及20nmol/l的DES作用于细胞48h时,Western Blot分析结果显示,与对照组比较,OA能抑制细胞水平PP2A蛋白的表达,DES能促进细胞水平PP2A蛋白的表达。结论:***及DES可以改变人子宫内膜癌Ishikawa细胞PP2A的表达,其中OA抑制PP2A的表达,DES促进PP2A的表达。***及DES作为常用的外源性PP2A的抑制剂和激动剂,通过对细胞水平PP2A的表达的改变,从而影响了Ishikawa细胞的生物学功能,其中包括细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期。

关键词： 细胞生物学   选择性自噬   ULK复合物   自噬受体蛋白   磷酸化修饰  

摘要： 细胞自噬是真核细胞中一种在进化上高度保守的、溶酶体依赖的细胞内降解过程，主要用于降解细胞内蛋白质、细胞器等物质，对于维持细胞内稳态以及促进细胞的生长、发育和存活具有至关重要的作用。选择性自噬通过自噬受体蛋白来降解特定的底物，包括蛋白聚集体、线粒体、过氧化酶体以及外源性的入侵病原体等。在哺乳动物细胞中，ULK复合物（由ULK1、ATG13、ATG101、FIP200四个亚基组成）参与早期自噬体的形成。在一些选择性自噬过程中，自噬受体蛋白可通过结合ULK复合物中的FIP200亚基，招募ULK复合物，并在自噬底物附近原位（in situ）促进自噬前体的形成。但是，目前ULK复合物的具体组装机制、相关的调控机理以及通过其FIP200亚基结合自噬受体的分子机制仍然未知。本文主要研究FIP200识别自噬受体蛋白的分子机制，ULK复合物中ULK1、ATG13、FIP200亚基的LIR基序与ATG8家族蛋白之间的相互作用机制以及ULK1与ATG13亚基之间的相互作用机制。　　本文第二章对FIP200Claw结构域识别自噬受体蛋白Optineurin、CCPG1的分子机制展开了详细的研究。首先我们发现CCPG1FIR2基序区间的磷酸化修饰以及TBK1激酶介导的Optineurin LIR区间的磷酸化修饰会调控和增强FIP200Claw与CCPG1FIR2或Optineurin LIR的相互作用。随后通过X射线单晶衍射方法我们首次解析了FIP200Claw结合磷酸化的CCPG1FIR2(p-CCPG1FIR2)和Optineurin LIR(p-Optineurin LIR)的复合物的晶体结构。相关的结构分析显示FIP200Claw以稳定的二聚体存在，并对称地结合两个磷酸化的LIR或FIR形成异源四聚体，并且p-CCPG1FIR2与p-Optineurin LIR中的磷酸化修饰对增强它们与FIP200Claw相互作用的机制是不同的。最后，基于解析的复合物结构和相关的生化研究，我们首次定义了可与FIP200Claw发生相互作用的FIR基序的序列模式，并且分析发现许多自噬受体蛋白的经典LIR区间可能包含了FIR基序，发挥招募FIP200的功能。同时进一步地生化实验表明CCPG1FIR2或Optineurin LIR可以通过相同的氨基酸残基竞争结合FIP200Claw和ATG8家族蛋白。鉴于CCPG1同时含有LIR与2个FIR基序，CCPG1蛋白如何调控与FIP200及ATG8家族蛋白的相互作用还有待进一步的研究。总之，在本章研究中，我们首次揭示了自噬受体蛋白结合FIP200Claw是一种通用的、受磷酸化调控的新机制，对进一步理解自噬受体蛋白介导的选择性自噬过程具有重要的指导性意义。　　本文第三章研究了ULK复合物中ULK1的LIR基序与ATG8家族蛋白成员GABARAP的相互作用机制。过去的研究认为自噬受体蛋白通过结合FIP200，招募ULK复合物，接着自噬受体蛋白上的LIR基序招募ATG8家族蛋白，进一步帮助自噬前体膜的生长。通过氨基酸序列分析，我们发现ULK1、ATG13、FIP200都含有一个LIR基序。进一步通过生化实验，我们发现ULK1、ATG13、FIP200的LIR基序对6个ATG8家族蛋白具有一定的选择性，其中对于GABARAP的结合性最强。随后，我们采用X射线单晶衍射的方法解析了ULK1LIR/GABARAP复合物的晶体结构，通过结构分析揭示了ULK1LIR对GABARAP的偏好性机制，并进一步通过ITC实验和免疫共沉淀实验在体内、体外验证了结构的正确性。　　本文第四章研究了ULK1与ATG13的相互作用机制。过去的研究表明ULK1可通过其C端的MIT结构域与ATG13的C端的MIM基序发生相互作用，但具体的分子机制未知。我们首先通过共表达的方法获得了ULK1MIT和ATG13MIM的复合物蛋白，并进一步利用凝胶色谱共迁移和分析型超速离心(AUC)方法表征了该复合物蛋白的相关属性，发现该复合物的均一性并不是很好。为了便于后续的结构生物学研究，我们尝试了蛋白片段优化以及盐浓度、DTT浓度的优化，但均不能获得均一性良好的复合物蛋白。鉴于ULK1与ULK2有很高的同源性，我们又尝试了ULK2蛋白。通过生化实验，我们确认了ULK2与ATG13之间存在直接的相互作用，并获得ULK2MIT和ATG13MIM的复合物蛋白，但始终无法获得复合物的晶体。因此，ULK2和ATG13具体的相互作用机制还有待进一步的研究。　　总之，本文主要关注ULK复合物的组装及与自噬受体蛋白的相互作用机制。我们首次揭示了自噬受体蛋白Optineurin和CCPG1通过磷酸化修饰增强与FIP200Claw相互作用的分子机制，并首次定义了结合FIP200的Claw结构域的F

关键词： 乳腺癌   乳酸脱氢酶C4   肿瘤   糖酵解   乳酸  

摘要： 目的:1.研究乳腺癌患者的癌组织中乳酸脱氢酶C4(LDH-C4)的表达及其临床意义。2.探讨LDHC基因表达上调和下调对乳腺癌HCC1937细胞生物学功能的影响,并探讨可能的分子机制。方法:1.运用免疫组化技术检测LDH-C4蛋白在乳腺癌患者癌组织、癌旁正常组织中的表达水平,分析判断LDH-C4蛋白表达水平与临床参数间的相关性以及在乳腺癌预后评估中的作用。2.构建LDHC基因过表达慢病毒载体和LDHC基因敲减的慢病毒载体,同时将不同的载体感染乳腺癌细胞HCC1937,利用嘌呤霉素筛选目的细胞株,用RT-q PCR鉴定LDHC基因过表达和下调的效果。通过绘制细胞CCK-8生长曲线、计数Transwell小室侵袭迁移过的细胞数量、计算划痕迁移修复的面积等,研究LDH-C4表达改变对于乳腺癌细胞HCC1937细胞生物学功能的影响改变。3.通过微板法检测糖酵解途径乳酸、丙酮酸、葡萄糖等物质改变,通过Western blot检测AKT/mTOR相关通路的蛋白分子表达情况。结果:***-C4蛋白在145例乳腺癌患者的癌组织中均检测到存在不同程度的阳性表达,但在乳腺癌患者中表达明显上调。临床参数结果显示,LDH-C4的表达与患者的N分期、组织分级以及淋巴结转移存在正相关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存预后分析曲线结果显示,LDH-C4高表达的患者其生存预后质量明显较差(P<0.05)。Cox模型结果显示LDH-C4蛋白表达水平是乳腺癌不良预后的一种因素(P<0.05)。2.获得稳定过表达和敲减LDHC基因的乳腺癌细胞,细胞功能学实验结果显示,LDH-C4高表达可以促进乳腺癌细胞HCC1937迁移以及侵袭等恶性生物学行为,相反地敲减LDH-C4可以抑制乳腺癌细胞HCC1937迁移和侵袭过程,但是LDH-C4的表达改变对乳腺癌细胞HCC1937的生长增殖没有影响。3.上调LDHC基因的表达,乳腺癌细胞HCC1937对葡萄糖底物的消耗量增加,丙酮酸的生成减少,乳酸的产物增加;下调LDHC基因表达,乳腺癌细胞HCC1937能量代谢减慢,对葡萄糖的利用减少,对乳酸的转化生成减少,而丙酮酸的转化量增加。Western blot实验结果显示,在乳腺癌细胞HCC1937细胞中,LDH-C4高表达可以促使细胞中AKT蛋白以及mTOR蛋白表达水平也随之增加,而LDH-C4低表达时AKT、mTOR蛋白表达量减少。结论:***-C4蛋白在乳腺癌癌组织中存在高表达,且蛋白高表达与乳腺癌患者的不良预后存在正相关。***-C4高表达可以促进乳腺癌细胞HCC1937侵袭和迁移的恶性行为,LDH-C4敲减可以减弱侵袭和迁移的能力。***-C4蛋白可能通过调控糖酵解途径和AKT/mTOR信号通路参与乳腺癌细胞的发生发展进程。

关键词： 形成性评价   细胞生物学   教学活动  

摘要： 在教学过程中,为调节和完善教学活动,确定学生的学习成果,保证教学目标得以顺利实现,我们将形成性评价引入细胞生物学的教学实践中,通过对2018级中医学专业两个班级进行终结性评价和形成性评价的教学效果对比和问卷调查,其结果显示形成性评价有助于学生知识、能力、素质协调发展。同时,还能帮助教师了解教学效果,反思教学,改进教学。

关键词： 动脉粥样硬化   虾青素   ROS   氧化应激   细胞自噬   细胞凋亡  

摘要： 背景与目的：虾青素是天然存在的类胡萝卜素，由于化学结构两端每个芳香环上各有一个羟基和不饱和羰基，使其具有显著的抗氧化能力。氧化应激是机体氧化和抗氧化系统之间的稳态被破坏而造成的应激状态。氧化应激中产生的活性氧(ROS)能诱导自噬产生，而自噬能够缓解氧化应激造成的损伤，从而保护细胞得以存活。本研究拟探讨虾青素通过清除氧化因子调节平滑肌细胞的自噬和凋亡的机制，以及对平滑肌细胞的生物学行为的影响。　　方法：1.培养及鉴定人主动脉平滑肌细胞(T/G HA-SMC);2.采用CCK-8、MTT法分析不同浓度虾青素及过氧化氢对传代培养的T/GHA-SMC活力的影响，检测细胞内ROS的量、线粒体膜电位，利用AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡，WesternBlot技术检测细胞自噬和凋亡相关蛋白表达差异;3.建立颈总动脉损伤的小鼠模型，给予虾青素灌胃，HE染色检测动脉壁损伤及平滑肌细胞增殖状态。　　结果：CCK-8结果显示虾青素对T/GHA-SMC的最佳保护浓度为25μM，过氧化氢半数最大抑制浓度(IC50)为200μM。虾青素处理后，过氧化氢对T/GHA-SMC氧化应激作用减弱，表现为ROS水平降低，线粒体膜电位回升，自噬相关蛋白表达上调，抑制凋亡(P＜0.01);虾青素治疗减轻颈动脉损伤小鼠局部血管壁的增生(P＜0.01)。　　结论：虾青素通过抑制T/GHA-SMCROS的产生，抑制氧化应激反应，从而抑制细胞的自噬作用，减少细胞凋亡，同时对损伤后小鼠血管壁细胞增生有一定的抑制作用。

关键词： 子宫内膜异位症   BCAR3   miR-126-5p   在位内膜间质细胞   在位内膜上皮细胞   雌激素   上皮间质转化   细胞生物学行为  

摘要： 目的:子宫内膜异位症(endometriosis,EMs,简称内异症)是妇科常见病及难治病。内异症虽为良性疾病,却可表现出局部种植、侵袭及远处转移等类似恶性行为,常引起进行性痛经、慢性盆腔痛及不孕等症状,严重影响患者的身心健康。近年来,随着对内异症发病机制研究的深入,人们已认识到内异症一种雌激素依赖的多因素疾病:内异症在位内膜细胞功能改变,如细胞增殖、迁移及侵袭增强,及经血逆流可能是形成异位种植的基本条件,而免疫功能异常及异位病灶雌激素代谢改变等同样在内异症发生中起重要作用。BCAR3(Breast cancer anti-estrogen resistance 3)基因,又称AND-34或NSP2,属NSP(novel Src homology2(SH2)-containing protein)家族。有报道显示BCAR3异常高表达可增强细胞粘附、迁移及侵袭,并促进细胞生发上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)。此外,BCAR3蛋白能在活体外诱导雌激素依赖性乳腺癌细胞对抗雌激素药物产生耐药,是导致雌激素受体阳性乳腺癌患者抗雌激素药物耐药而使内分泌治疗失败的重要原因之一。抗雌激素作用是避免内异症发生的保护因素,而局部抗雌激素作用被抑制将促进异位病灶形成。那么,BCAR3是否为促进内异症发生、发展的候选基因之一值得探讨。生物信息学预测软件结果显示BCAR3基因是miR-126-5p下游靶标之一。miR-126-5p及miR-126-3p来自同一前体pre-miR-126,在多种组织及细胞中表达水平相当,变化趋势相同,发挥相似的功能。在癌细胞中,miR-126-5p、miR-126-3p表达的降低可增强癌细胞增殖、侵袭能力。本课题组前期研究显示:miR-126-3p在内异症在位内膜间质细胞中低表达,其表达水平下降导致间质细胞增殖、侵袭性显著增强。那么miR-126-5p是否在内异症中表达异常及是否可通过靶向调节BCAR3基因调控内膜细胞功能有待验证。本研究旨在围绕BCAR3基因对内异症在位内膜细胞功能的影响及可能的调控机制进行研究,为内异症发病机制提供新的理论依据。研究方法:本研究选取32例内异症患者的异位内膜和在位内膜及31例对照组子宫内膜作为研究对象,收集临床资料,通过实时荧光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction、qRT-PCR)、免疫组化及蛋白免疫印迹方法(Western blot)方法检测BCAR3蛋白及m RNA的表达情况,通过qRT-PCR检测上述样本中miR-126-5p的表达情况,进行相关性分析。通过免疫组化技术检测异位内膜、在位内膜及正常内膜中间质细胞相关蛋白波形蛋白(vimentin)及上皮细胞相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达情况。体外培养原代在位内膜上皮细胞,通过慢病毒构建BCAR3过表达模型,利用Western Blot检测细胞感染后BCAR3蛋白表达情况,通过观察细胞形态及Western Blot检测E-cadherin、vimentin及纤连蛋白(fibronetin)蛋白表达情况,评估BCAR3对内异症上皮间质转化的影响。雌激素单独或联合雌激素拮抗剂处理在位内膜上皮细胞或过表达BCAR3的上皮细胞,观察细胞形态及Western Blot检测E-cadherin、vimentin及fibronetin蛋白表达情况。联合雌激素与BCAR3高表达慢病毒处理在位内膜上皮细胞后再次观察细胞形态,检测E-cadherin、vimentin及fibronetin蛋白表达情况。利用体外在位间质细胞原代培养,采用Western blot及qRT-PCR对内膜间质细胞中BCAR3及miR-126-5p表达量进行检测并分析相关性。内异症在位内膜间质细胞中转染miR-126-5p agomir,正常内膜间质细胞antagomir,qRT-PCR验证转染效率后,利用CCK8及Transwell检测细胞增殖及迁移、侵袭能力,Western Blot检测BCAR3蛋白水平。通过慢病毒构建BCAR3过表达及敲低模型,western blot检测慢病毒感染后BCAR3蛋白水平后,利用CCK8及Transwell检测细胞增殖及迁移、侵袭能力。培养293T细胞,将含有野生型BCAR3 3’UTR(WT-BCAR3)或突变型BCAR3 3’UTR(Mut-BCAR3)的pMIR-report报告基因质粒与miR-126-5p agomir共转染293T细胞,利用Dual-Glo?Luciferase Assay System检测荧光素酶活性。Pre-miR-126-5p重组慢病毒感染在位内膜间质细胞,

关键词： 动脉粥样硬化程度   环指蛋白10   平滑肌细胞   生物学特性   动态变化  

摘要： 目的:构建动脉粥样硬化动物模型,探究动脉粥样硬化发生发展的不同阶段时RNF10(环指蛋白10)表达水平的动态变化以及平滑肌细胞生物学特性的变化情况。方法:选取ApoE基因敲除鼠(ApoE-/-)共24只,采用空气干燥法损伤小鼠的颈动脉并以高脂饲料进行饲养,诱导动脉粥样硬化的形成。将24只小鼠中随机分为A、B、C、D四组(每组6只),其中A组作为正常对照组(小鼠不做颈动脉损伤处理并采用普通饲料饲养),B组小鼠在颈动脉损伤后采用高脂饲料连续喂养8周,C组小鼠在颈动脉损伤后采用高脂饲料连续喂养12周,D组小鼠在颈动脉损伤后采用高脂饲料连续喂养16周。在各时间点处死小鼠,分离平滑肌细胞并进行原代培养。颈动脉样本进行HE染色和油红O染色并观察,采用免疫组化检测RNF10、SMA、SMHC、VEGF的表达情况。采用免疫荧光对细胞进行鉴定,CCK8实验检测各组细胞的增殖活性,流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况,采用划痕实验来检测各组细胞迁移能力的变化,蛋白免疫印迹法检测平滑肌细胞中RNF10、SMA和SMHC蛋白的表达水平,细胞免疫荧光检测各组平滑肌细胞表型的变化情况。结果:HE实验结果显示B组样本中可见动脉内膜有少量增厚,泡沫细胞聚集,出现脂质沉积;C组可见胶原纤维,出现玻璃样变,内膜大量下脂质沉积、脂质纤维帽形成;D组组织样本中可观察到动脉内膜的显著增厚,局部胆固醇结晶和钙盐沉积,大量的泡沫细胞聚集。油红O染色显示A组无明显着色,B、C、D三组中有明显染色,且染色面积占总面积的比率逐渐增高。这证实动脉粥样硬化的动物模型构建成功,且B、C、D组分别呈现出不同程度的动脉粥样硬化病变。免疫组化染色结果显示:A组中可见组织内RNF10、SMA和SMHC染色强阳性,VEGF染色阴性。B组斑块组织内RNF10、SMA和SMHC染色阳性染色,VEGF染色阳性。C组斑块组织内SMA和SMHC染色呈弱阳性,VEGF染色呈强阳性。D组中组织内SMA和SMHC染色阳性,VEGF染色阳性。CCK8实验结果显示:与正常对照组相比,其余三组细胞的增殖能力有显著提高,且其细胞活性在三组中呈现逐渐增高的趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术结果显示:与正常对照组相比,B、C两组中细胞的凋亡率明显地降低,处于G0/G1期的细胞比例明显降低;S期细胞的占比明显增高,该差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验结果:在划痕后第12h时,各组细胞可观察到较明显的迁移,其中A组中的划痕宽度约0.90cm,B组划痕约0.65cm,C组划痕约0.55cm,D组划痕约为0.5cm;在24h时,A组划痕约0.60cm,B组划痕约0.40cm,C组划痕约0.20cm,D组划痕基本闭合。western Blot实验结果显示:于A组相比,RNF10、SMA和SMHC在其他三组中的表达量明显更低(P<0.05)。RNF10、SMA和SMHC的表达在B、C组中逐渐下降,在D组中小幅度提高,但表达水平仍然低于A组。然而,VEGF在其余三组中的表达量相较于A组都有较明显提高(P<0.05)。细胞免疫荧光实验显示:与A组相比较,RNF10、SMA和SMHC在其他三组中的表达量明显降低,细胞的表型有改变。RNF10、SMA和SMHC在组织和平滑肌细胞中的表达水平均先逐渐降低然后升高,但仍显著低于正常水平。结论:用空气干燥法ApoE-/-鼠内膜后再用高脂饮食处理可以更快地获得动脉粥样硬化的动物模型。与正常血管组织相比,RNF10、SMA和SMHC在动脉粥样硬化的组织中的含量明显降低,VEGF的含量有增高。随动脉粥样硬化的程度增高,平滑肌细胞的表型开始改变,细胞的增殖迁移能力均逐渐提高,RNF10、SMA和SMHC在细胞中的表达水平均先逐渐降低然后升高,但仍显著低于正常水平。RNF10可能在动脉粥样硬化的发生发展中有重要作用,其表达情况与动脉粥样硬化密切相关。