关键词：
奶牛
乳腺炎
环状RNA
乳腺上皮细胞
泌乳
增殖
炎性应答
摘要：
奶牛乳腺炎是由物理、化学以及微生物感染等引起的乳腺组织炎症反应,其中最常见的微生物是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。当这两种病原微生物侵入奶牛乳腺组织时,分别以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)作为主要毒力成分刺激乳腺组织产生不同程度的炎症反应甚至影响泌乳。环状RNA(circular RNA,circ RNA)是近年来广泛研究的非编码RNA,是pre-m RNA可变剪切过程中产生的闭合环状RNA分子,已有大量研究表明环状RNA参与多种疾病进程的调控,但circ RNA在奶牛乳腺炎中的相关作用研究甚少。实验室在前期高通量测序结果中发现了一个circ RNA,其在病原菌诱导下的奶牛乳腺上皮细胞的表达水平显著降低,由于其经DNA引物酶亚基2(DNA primase subunit 2,PRIM2)第8和第9外显子反式剪切形成,故将其命名为circ RNA PRIM2(circ PRIM2)。本研究在验证测序结果的基础上,分析了该环状RNA的基本特性,并通过在乳腺上皮细胞中过表达circ PRIM2,探索了其对乳腺上皮细胞增殖与活力、酪蛋白分泌以及炎性应答的影响及初步作用机制。首先,建立了LPS和LTA体外诱导奶牛乳腺上皮细胞模型,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real time quantitive PCR,RT-q PCR)检测circ PRIM2的表达水平,结果显示,在炎性诱导下,circ PRIM2在乳腺上皮细胞中的表达水平明显降低,与高通量测序结果相一致。其次,采用RT-q PCR检测奶牛的乳腺、心脏、肝脏、脾、胃、肺、肾、肠等不同器官组织中circ PRIM2的表达量,结果显示,circ PRIM2在肺组织中表达量较高,而在乳腺组织中基础表达水平较低。再次,为了探究circ PRIM2对奶牛乳腺上皮细胞功能的影响,本试验建立了circ PRIM2稳定过表达的乳腺上皮细胞系,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测了β-酪蛋白的分泌,结果显示,过表达circ PRIM2促进β-酪蛋白分泌;采用Ed U法和CCK-8方法检测过表达circ PRIM2对奶牛乳腺上皮细胞的增殖和活力的影响,结果显示,过表达circ PRIM2抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖和活力;采用RT-q PCR检测对其亲本基因m RNA水平的影响,发现过表达circ PRIM2促进炎性乳腺上皮细胞中其亲本基因的表达。最后,探究了circ PRIM2对乳腺上皮细胞炎性应答的影响及初步机制,采用RT-q PCR和ELISA分别检测了乳腺上皮细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的m RNA表达水平和蛋白分泌水平,结果显示过表达circ PRIM2抑制LPS和LTA诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6的m RNA表达和蛋白的分泌,通过蛋白免疫印迹技术检测NF-κB信号通路关键信号分子磷酸化P65和总P65表达水平,结果显示,过表达circ PRIM2通过抑制P65的磷酸化抑制NF-κB信号通路的激活。综上所述,炎性状态下,circ PRIM2在乳腺上皮细胞中表达水平降低,过表达circ PRIM2促进乳腺上皮细胞对β-酪蛋白的分泌,抑制乳腺上皮细胞增殖和活力,促进LPS和LTA诱导的炎性乳腺上皮细胞中circ PRIM2亲本基因的表达,通过调节NF-κB信号通路的激活来抑制乳腺上皮细胞的炎性应答。
欢迎来到三峡大学图书馆！
