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关键词： 脂肪干细胞   传代   培养   增殖   分化  

摘要： [目 的]进行脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的取材、分离、提纯、培养和传代,并对其进行观察和检测鉴定,研究脂肪干细胞在分化和培养增殖过程中的各方面生物学特性,研究不同次代脂肪干细胞的增殖能力和分化能力并进行对比和分析。加深对脂肪干细胞各种特性的了解,为下一步进行脂肪干细胞治疗肠瘘的实验研究奠定基础。[方 法]分离得到脂肪干细胞,并进行提纯和传代培养,通过观察形态特征和表面标记物CD29、Sca-1、CD34、CD45的流式细胞术检测对分离的细胞进行鉴定。在培养的脂肪干细胞中选取生长良好的P3、P6、P10、P15代,通过使用CCK8试剂盒检测、PI染色后流式细胞术检测和蛋白质印迹检测细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK4的表达等检测ADSCs的增殖能力。选取P3、P6、P10、P15不同代次脂肪干细胞,通过成骨诱导分化后茜素红染色后观察成骨情况和QPCR检测成骨基因R unx-2、ALP和Osterix的表达情况来检测不同代次的成骨诱导分化情况。[结 果]1.取大鼠脂肪组织经分离、提纯后得到脂肪干细胞,传代培养后观察可见,传至第3代左右脂肪干细胞纯度较高,生长活跃,此时脂肪干细胞形态多梭形,呈螺旋状生长,生长过程呈S形,一般前3天处于潜伏期,4-8天呈对数期生长,8天后处于平台期。通过使用CD29、Sca-1、CD34、CD45抗体与脂肪干细胞反应后流式细胞术检测,对分离出脂肪干细胞进行鉴定,结果发现CD29、Sca-1两个蛋白均表达的细胞含量在97.567%,二者皆为阳性表达,CD34阳性细胞6.919%;CD45阳性细胞0.839%,CD34、CD45均为阴性表达。可以确定分离的细胞为ADSCs。2.使用CCK8试剂盒检测脂肪干细胞P3、P6、P10、P15不同代次细胞生长情况,显示P3和P6低代次细胞在24h、48h、72h、96h细胞增殖活性旺盛,P3代和P6代之间无明显差异,至P10代细胞增殖活性明显减弱,P15代细胞增殖活性进一步减弱。PI染色后流式细胞术检测P3、P6、P10、P15代脂肪干细胞周期分布情况,结果显示P3和P6低代次细胞G0/G1期细胞较少且明显少于P10、P15代。蛋白质印迹分析检测P3、P6、P10、P15代脂肪干细胞细胞周期相关蛋白 CyclinD1、CDK4 的表达情况,显示 P3、P6 代 CyclinD1、CDK4 低表达,P10、P15代相对表达较高。3.对P3、P6、P10、P15不同代脂肪干细胞次进行成骨诱导分化后,茜素红染色后镜下观察,可见P3、P6低代次细胞比P10、P15代骨细胞细胞数量更多。通过QPCR检测脂肪干细胞细胞P3、P6、P10、P15不同代次脂肪干细胞中成骨相关基因Runx-2、ALP和Osterix的表达,结果显示P3和P6低代次细胞中Runx-2、ALP和Osterix基因的表达明显高于P10、P15代。[结 论]1.提取大鼠脂肪组织,进行分离、提纯、培养、传代等,经观察和表面标记物鉴定确定为脂肪干细胞。2.对P3、P6、P10、P15不同代次脂肪干细胞增殖能力检测,P3、P6低代次细胞增殖活性明显高于P10、P15代。3.P3、P6、P10、P15不同代次脂肪干细胞进行成骨诱导分化检测中,P3、P6低代次细胞分化能力明显高于P10、P15代。4.从增殖活性、分化能力等方面看,脂肪干细胞中低代次细胞在增殖活性和分化能力方面更优越,可能更适合作为继续培养和进一步实验和治疗的材料。

关键词： miR-128   DJ-1   子宫内膜癌细胞   PTEN   PI3K/Akt信号通路  

摘要： 目的:在细胞水平上探讨miR-128是否通过PTEN/PI3K/Akt信号通路调控DJ-1蛋白的表达,进而影响Ishikawa子宫内膜癌细胞的增殖、细胞周期、凋亡、侵袭迁移等生物学功能。方法:1.利用Real time RT-PCR技术分别检测正常子宫内膜组织、子宫内膜癌组织、正常子宫内膜细胞系ESC以及子宫内膜癌细胞系Ishikawa中miR-128、PTEN mRNA、DJ-1 mRNA表达情况;同时,利用Western blot技术分别检测上述组织和细胞系中DJ-1、PTEN、磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白表达水平;此外,利用统计学方法初步分析子宫内膜癌组织和细胞系中miR-128表达与DJ-1及PTEN表达的相关性。***-128 mimics和miR-128 inhibitor分别转染Ishikawa细胞,并设立相应的阴性对照,转染48 h后,通过Real time RT-PCR检测miR-128表达水平的变化,Western blot检测DJ-1、PTEN、p-Akt蛋白表达水平的变化,以求明确调控Ishikawa细胞内miR-128表达水平是否影响PTEN/PI3K/Akt通路及DJ-1的表达。3.将PTEN siRNA转染或与miR-128 inhibitor共转染Ishikawa细胞,并设立相应的对照组,转染48 h后,通过Real time RT-PCR检测miR-128表达水平的变化,Western Blot检测PTEN、p-Akt、DJ-1蛋白表达水平的变化,以求观察Ishikawa细胞内PTEN沉默是否影响miR-128、p-Akt、DJ-1的表达。同时旨在观察Ishikawa细胞内miR-128抑制对p-Akt及DJ-1表达所产生的影响是否被PTEN沉默所逆转。***细胞用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002预处理24 h,或Ishikawa细胞经miR-128 mimics转染48 h后再用LY294002预处理24 h,随后,通过Real time RT-PCR检测miR-128表达水平的变化,Western Blot检测PTEN、p-Akt、DJ-1蛋白表达水平的变化,旨在观察Ishikawa细胞内PI3K/Akt通路抑制是否影响miR-128、PTEN及DJ-1的表达;同时,观察Ishikawa细胞内miR-128上调对PTEN、p-Akt及DJ-1表达所产生的影响是否被LY294002所逆转,从而进一步明确Ishikawa细胞内miR-128、PTEN/PI3K/Akt通路及DJ-1之间上下游关系。5.将miR-128 mimics转染Ishikawa细胞,同时结合LY294002或DJ-1 siRNA干预,通过对以下指标的检测,明确miR-128经PTEN/PI3K/Akt信号通路调控DJ-1蛋白表达后,是否进一步影响Ishikawa子宫内膜癌细胞生物学功能:(1)CCK-8实验及细胞克隆实验检测细胞增殖的变化;(2)流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡情况的变化;(3)细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化;(4)Transwell实验检测细胞侵袭能力的变化。结果:1.与正常子宫内膜组织相比较,子宫内膜癌组织中miR-128、DJ-1 mRNA及蛋白、p-Akt蛋白的表达水平均显著增加,而PTEN mRNA及蛋白表达水平明显下降;同样,与ESC正常子宫内膜细胞系相比,Ishikawa子宫内膜癌细胞系中miR-128、DJ-1 mRNA及蛋白、p-Akt蛋白的表达也均明显上调,而PTEN mRNA及蛋白表达显著下调。有趣的是,通过相关性统计分析发现,子宫内膜癌组织和细胞系中miR-128表达与PTEN表达呈负相关,而与DJ-1表达呈正相关。***-128 mimics转染Ishikawa细胞后,miR-128表达上调,同时伴随PTEN蛋白表达下调,p-Akt及DJ-1蛋白表达上调;相反,miR-128 inhibitor转染Ishikawa细胞后,miR-128表达下调,同时伴随PTEN蛋白表达增加,p-Akt及DJ-1蛋白表达下降。*** siRNA转染Ishikawa细胞后,PTEN蛋白表达显著下调,而miR-128表达无明显变化,但p-Akt及DJ-1蛋白表达显著上调;此外,miR-128 inhibitor转染上调PTEN蛋白表达及下调p-Akt和DJ-1蛋白的效应均可被PTEN siRNA所抑制,但miR-128 inhibitor转染下调miR-128表达的效应不受PTEN siRNA影响。***294002预处理Ishikawa细胞后,p-Akt及DJ-1蛋白表达显著下调,但miR-128及PTEN表达水平无明显变化;此外,miR-128

关键词： 河北省   分子细胞生物学   重点实验室  

摘要： 河北省分子细胞生物学重点实验室建成于2000年,其前身为孙大业院士创建的河北师范大学生物系细胞生理研究室.经过30年的发展,实验室以科学研究带动学科建设,以学科建设推动实验室建设,在国内乃至国际植物细胞生物学研究领域产生了重要影响.

关键词： 膀胱癌   has＿circ＿0054123   miR147a   MCM3  

摘要： 目的:膀胱癌（BC,bladder cancer）是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。它也是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一,它不仅会影响泌尿系统功能,而且膀胱癌极易复发,对患者的生存质量造成极大威胁。虽然目前针对膀胱癌的生物学特性的研究上,已经取得了诸多成就,然而,在对膀胱癌治疗上,目前仍主要局限于手术及化学治疗,在对膀胱癌生物学特性如增殖、转移并利用此种特性调节甚至治疗膀胱癌的研究却少之又少。在近期的研究中有越来越多的证据表明MCM（Minichromosome maintenance,微小染色体维持蛋白）家族在肿瘤的发生发展上,起到了至关重要的作用。目前已有报道证实在大多数人类癌症（例如结肠癌,肺癌,胃癌,肾癌和乳腺癌等）中MCM3基因均呈过表达状态。并且,MCM3被认为是一种参与细胞分裂的关键因子。环状RNA（circ RNA）可以通过充当mi RNA（micro RNA,小RNA）海绵,从而降低其靶向m RNA的能力来调节基因。然而在膀胱癌中,此条完整的调节路径却鲜有研究,因此,本文对circ RNA/mi RNA/MCM3通路在膀胱癌中对膀胱癌细胞生物学特性的影响以及其详细机制进行探索,为膀胱癌的临床治疗提供新的思路。方法:1.筛选及检测MCM3的上游mi RNA通过对Targetscan、mi RBase、mi RWalk等生信网站数据分析,预测出与MCM3m RNA有结合位点、保守且未在膀胱癌中被研究的mi RNA。再通过双荧光素酶报告基因（Luciferase）等实验证明MCM3与上游预测的mi RNA的结合。从我院的标本库中通过随机方法选出30对病理诊断明确的膀胱癌标本,再通过提取癌及相应癌旁组织中的总RNA及蛋白;培养T24、UMUC3、J82、5637这4种有代表性的膀胱癌细胞系及一种SV-HUC-1（上皮永生化）细胞,提取RNA及蛋白,通过PCR检测技术检测MCM3 m RNA及mi RNA表达量,利用蛋白免疫印迹试验（Western blot,WB）实验检测MCM3蛋白表达情况。分析MCM3及相应mi RNA在细胞中表达相关性。选取两种膀胱癌细胞系进行后续实验。2.明确mi RNA对MCM3的调控机制以及mi RNA在膀胱癌细胞系中的生物学功能对膀胱癌细胞系分别转染mi RNA模拟物/抑制物（mimics/inhibitor）后检测MCM3 m RNA及蛋白水平变化。再根据生信的预测位点,构建野生型及突变型双荧光素酶报告基因质粒,通过Luciferase实验来判定mi RNA与MCM3 m RNA 3'-UTR区是否有特异性结合。对膀胱癌细胞系转染mi RNA的mimics/inhibitor及NC对照,利用Ed U实验来检测转染后的膀胱癌增殖水平;用未经处理的Transwell小室来检测细胞转染后的转移能力;用经过基质胶处理过的Transwell小室来检测细胞转染后的侵袭能力。用回复实验检测mi RNA对膀胱癌细胞生物学功能实验的影响并证明此影响是通过调控MCM3来现在的。3.筛选及验证mi RNA的上游circ RNA利用RNAhybrid等生信网站预测出与目的mi RNA具有结合位点、保守且未在膀胱癌中被研究的circ RNA。再通过Luciferase等实验证明circ RNA是否与所研究mi RNA具有相同的结合位点。*** RNA在膀胱癌中的生物学功能及通过mi RNA对m RNA的调控在膀胱癌细胞系中转染CIRC-si RNA,利用Ed U实验来检测转染后细胞的增殖能力;利用未经处理的Transwell实验来检测细胞转染后的转移能力;用经过基质胶处理过的Transwell实验来检测细胞转染后的侵袭能力。回复实验证明circ RNA对膀胱癌细胞生物学功能实验的影响并证明此影响是通过调控mi R147a/MCM3来现在的。5.裸鼠成瘤进行膀胱癌细胞体内成瘤实验,我们选取周龄为4-6w品系为Balb/c的雌性裸鼠,每只鼠皮下注射100μl稳转MCM3过表达质粒/瞬转长效CIRC-si RNA后的UMUC3细胞,监测对比各组之间肿瘤生长情况。然后取所成的瘤体进行免疫组化,检测Ki-67及MCM3的表达变化判断circ RNA及MCM3对肿瘤增殖的影响。结果:***3在4种膀胱癌细胞系中的表达相较于对应的SV-HUC-1细胞呈高表达状态。MCM3在癌组织中的表达相于对相应的癌旁组织呈高表达状态。我们通过生信预测以及Luciferase实验发现,mi R147a与MCM3 m RNA有特异性结合位点,并且mi R147a可以抑制MCM3 m RNA以及MCM3蛋白表达。我们还发现mi R147a在膀胱癌组织中比对应的癌旁组织中表达量明显降低,在T24、UMUC3中较相应的SV-HUC-1细胞呈

关键词： 口腔鳞癌   白细胞介素-17   肿瘤干细胞   上皮间质转化  

摘要： 目的:口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常见的口腔恶性肿瘤,在口腔癌中约占90%,且近几十年来患者的5年生存率一直停留在50%左右。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是肿瘤组织中一类可以自我复制、多谱系分化和再生同源性肿瘤的瘤细胞,被称为“癌症根源”。众所周知,CSCs除了具有传统干细胞分裂增殖的能力,生成肿瘤组织外,同时在肿瘤的侵袭、转移、复发及耐药等方面也起着重要作用。肿瘤微环境对于肿瘤细胞尤其是肿瘤干细胞的调控,在肿瘤的发生发展及治疗中起着重要作用。因此了解肿瘤微环境对肿瘤细胞及肿瘤干细胞的调控方式及具体机制,对于提高肿瘤患者的生存率以及改善预后具有重要意义。本研究主要探讨肿瘤微环境中的白细胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)对于口腔鳞癌细胞干性及生物学行为的影响,同时研究在该过程中发生的上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是否是IL-17调控口腔鳞癌的主要机制,以期望为OSCC患者的治疗提供新的思路和策略,从而提高患者的治疗疗效及生活质量。方法:1.细胞分类:以口腔鳞癌细胞的干性标记CD133的表达情况对口腔鳞癌SCC9细胞进行分类,表达CD133的肿瘤细胞为肿瘤干细胞样细胞(Cancer Stem-like Cells,CSLCs),即CD133+SCC9,不表达CD133的肿瘤细胞为肿瘤非干细胞样细胞(Non-CSLCs),即CD133-SCC9。***-17浓度筛选:鉴于肿瘤实体组织内Non-CSLCs数量大于95%,因此对CD133-SCC9细胞进行的不同浓度IL-17处理,浓度梯度分别设为25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml,通过CCK8增殖实验测量处理0h、24h、48h、72h后各组细胞的增殖能力,选择促CD133-SCC9细胞增殖能力最强时所对应的IL-17浓度为最佳实验浓度,为口腔鳞癌细胞构建稳定表达IL-17的肿瘤微环境。3.细胞分组:将CD133+SCC9、CD133-SCC9两种细胞分别设置实验组与对照组,实验组进行等量的最佳浓度IL-17处理相同的时间(133+/17+、133-/17+),对照组加入等量细胞培养基(133+/17-、133-/17-)。4.干性检测:用免疫荧光实验及Western-blot技术检测处理前后CD133+SCC9、CD133-SCC9细胞的干细胞标记蛋白CD133表达情况。5.迁移及侵袭能力检测:分别用划痕实验、transwell侵袭实验检测处理前后两种细胞的迁移能力和侵袭能力。***相关标记物检测:用Western-blot技术检测处理前后两种细胞的E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白质表达水平的变化情况。结果:***8实验结果提示:一定浓度IL-17(25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、150ng/ml)能够促进CD133-SCC9增殖,且在75ng/ml时促增殖能力最明显,当浓度过高时(200ng/ml)则会抑制细胞的增殖(P均<0.05)。2.免疫荧光实验结果显示:同等条件下,CD133+SCC9细胞中CD133阳性细胞数及其表达强度明显高于CD133-SCC9细胞,且两组SCC9细胞在IL-17干预后CD133表达增加,该增加趋势在CD133+SCC9细胞中表现更为明显(P<0.05)。***-blot实验结果表明:相同条件下,CD133蛋白表达量在CSLCs中明显多于Non-CSLCs,与对照组相比,实验组CD133+SCC9、CD133-SCC9细胞干细胞标记蛋白CD133表达增加,且CD133+SCC9的增加趋势更为突出(P<0.05)。4.划痕实验结果提示:相同条件下CD133+SCC9细胞较CD133-SCC9细胞迁移距离多,与各自的对照组相比,实验组CD133+SCC9、CD133-SCC9细胞在24h及48h的迁移距离均较多,迁移能力均增强,且该增强趋势在CD133+SCC9细胞中表现更为明显(P<0.05)。***实验结果提示:相同条件下CD133+SCC9细胞较CD133-SCC9在48h后穿透基质胶的细胞数量更多,与各自的对照组相比,实验组CD133+SCC9、CD133-SCC9细胞在48h后穿透基质胶的细胞数量较多,侵袭性增强,且在CD133+SCC9细胞中增强趋势表现更突出(P<0.05)。*** Blot检测EMT相关标记物结果提示,相同条件下CD133+SCC9细胞较CD133-SCC9上皮性标记蛋白表达低,间质

关键词： 慢性粒细胞性白血病   骨髓间充质干细胞   外泌体   Notch   伊马替尼  

摘要： 背景:目前酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)在治疗慢性粒细胞性白血病(chronic myeloid leukemia,CML)上已取得了显著的效果,但有少部分患者对TKI原发耐药、还有部分患者在治疗过程中对TKI产生耐药导致疾病复发,这是治愈CML所面临需克服的重大难题。骨髓微环境是造血干细胞增殖、分化和成熟的土壤,与CML的发生、发展及耐药等过程息息相关。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)是骨髓微环境中的一种重要基质细胞,虽然数量占比不多,但近年被研究证明是影响CML细胞生物学特性的主要因素之一,且与CML耐药密切相关。本课题组前期研究发现BMMSCs可以影响CML细胞的生物学特性并能降低其对伊马替尼(Imatinib,IM)的敏感性。而外泌体(Exosome,Exo)是一种细胞外囊泡,在细胞间交流中起到非常重要的作用,被认为是介导细胞间通讯的新机制。故猜想BMMSCs-Exo是否可以产生类似母体细胞BMMSCs的生物学作用,与CML细胞进行交叉“对话”从而影响其生物学特性?同时研究表明Notch信号通路的异常激活与CML的发生发展密切相关。因此,Notch信号通路是否参与调控了BMMSCs-Exo影响CML细胞生物学特性的过程? 目的:本研究旨在探讨CML患者BMMSCs-Exo对CML细胞增殖、凋亡以及对IM治疗敏感性的影响,并观察Notch信号通路相关分子蛋白在该过程中的表达变化,为研究CML细胞对IM产生耐药的具体机制提供新思考。 方法:1、采用密度梯度离心法从CML患者骨髓液中分离出BMMSCs,并纯化传代培养;2、收集P3～P5代BMMSCs细胞培养的上清液,采用差速超高速离心法提取BMMSCs-Exo,用透射电镜观察形态、纳米颗粒跟踪分析检测粒径、Western blot检测表面标志等方法鉴定BMMSCs-Exo,BCA法测定BMMSCs-Exo的蛋白含量;3、设立0、12.5、25、50、100、200μg/ml浓度梯度的BMMSCs-Exo与K562细胞体外共培养48h后,采用CCK-8法检测各组K562细胞增殖情况、流式细胞术观察各组K562细胞周期的变化;4、设立K562、K562+200μg/ml BMMSCs-Exo、K562+IM、K562+IM+200μg/ml BMMSCs-Exo四组,分别培养48h后,Annexin V-FITC/PI双染后采用流式细胞术检测四组K562细胞的凋亡率、Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3的表达情况;以及四组K562细胞Notch信号通路相关蛋白Notch1及下游Hes1蛋白的表达情况。 结果:1、Ficoll密度梯度离心法分离原代CML患者BMMSCs,光学显微镜下观察BMMSCs呈典型的梭形,旋涡状生长。流式表型鉴定显示表达BMMSCs表面标志物CD90、CD105,不表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45。多向分化潜能实验显示可向成脂、成骨细胞分化。2、利用差速超高速离心法成功分离纯化CML患者BMMSCs-Exo,透射电镜下BMMSCs-Exo呈典型双膜托盘状,粒径分布集中在140nm左右,表达标志性蛋白CD63、CD9、TSG101、Alix。3、共培养后,运用CCK8法检测K562细胞增殖率发现,BMMSCs-Exo可抑制K562细胞增殖,并呈浓度依赖性,随着BMMSCs-Exo浓度增高,抑制作用逐渐增强,以200μg/ml BMMSCs-Exo共培养组抑制增殖作用最为显著。4、加入BMMSCs-Exo后观察到K562细胞凋亡率降低,且Western blot检测凋亡相关蛋白发现,共培养组Bcl-2表达量升高,Bax、Caspase3表达量降低。共培养后,加入IM,观察BMMSCs-Exo对K562细胞药物敏感性的影响,结果显示,BMMSCs-Exo可降低K562细胞对IM的敏感性,抑制IM引起的K562细胞凋亡,促使其耐药,进一步运用Western blot检测凋亡相关蛋白发现,共培养组Bcl-2表达量升高,Bax、Caspase3表达量降低。5、细胞周期检测显示,共培养后K562细胞的S期比例随着BMMSCs-Exo浓度增高而逐渐下降,而G0/G1期比例则逐渐增加,细胞周期发生明显阻滞,阻滞于G0/G1期,其中200μg/ml BMMSCs-Exo共培养组阻滞作用最明显。6、Western blot检测K562细胞Notch信号通路相关蛋白的表达水平发现,未加IM时,单独培养和共培养组K562细胞内Notch1及下游Hes1蛋白表达水平无差异,而加入IM后,对比K562+IM组,共培

关键词： 细胞质   临床技术   细胞生物学   生殖医学   单位膜   生物膜   属性分类   产妇死亡率   TPOAb   控制性促排卵   学科属性   多胎妊娠  

摘要： 46.无精子症(Azoospermia)释义指射出的精液离心沉淀后,经显微镜检查,仍查不见精子。学科属性分类泌尿外科学(320.2740)是否是MeSH词汇是,MeSH ID:D05371347.梗阻性无精子症(Obstructive azoospermia)释义睾丸有正常生精功能,由于输精道梗阻,使睾丸生成的精子不能排出体外。学科属性分类泌尿外科学(320.2740)是否是MeSH词汇否

关键词： 宫颈癌   miR-451   MIF   PI3K/AKT/mTOR信号通路   外泌体   化疗敏感  

摘要： 宫颈癌是严重影响女性健康的一大杀手,是妇科恶性肿瘤患者最常见的死亡原因。虽然宫颈癌疫苗的应用能够有效减少宫颈癌的发生,但每年仍有约80%的新发病例和85%的死亡病例发生在发展中国家,并且其中超过70%的病例在诊断时已处于局部晚期,称为局部晚期宫颈癌。虽然目前宫颈癌的治疗方式已很全面—手术、化疗、放疗及免疫治疗等,但并不是所有患者都能获得较好疗效,尤其对于局部晚期宫颈癌患者疗效仍较差。对于局部晚期宫颈癌,目前的治疗方式是新辅助化疗后对化疗敏感患者采取手术治疗,不敏感患者直接转为放疗,如果有能有效预测患者对化疗敏感性的指标,这部分对化疗不敏感患者就可以免去新辅助化疗的时间及花费,直接转去放疗,得到更好疗效。因此,继续深入研究宫颈癌的发病机制,寻找特异性的治疗靶点以及预测化疗敏感性的标志物对于宫颈癌的治疗仍极为重要。生物信息学是一门交叉学科,随着人类基因组计划的完成,测序数据的爆炸式增长,应用生物信息学技术分析基因组数据之间的关系成为目前一大趋势,用于揭示疾病发生发展及耐药的分子机制。GEO数据库,是美国国立卫生研究院NCBI于2000年创建的公共数据库,是目前最大、最全面的公共基因表达数据资源。外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为30-150nm的具有脂质双层膜的微小膜泡,富含miRNA等物质,通过内吞、外排等作用调节机体多种生理或病理反应,参与肿瘤微环境的调节,还可以作为载体靶向传递药物至器官发挥作用等。在本研究中,近年的研究发现miR-451不仅参与肿瘤的发生进展,还参与肿瘤化疗敏感性的调控,相较于其他miRNA,miR-451更易于在外泌体中富集。基于以上研究背景,在本研究中,先使用生物信息学方法筛选在宫颈癌中差异表达的miRNA,结合文献筛选确定miR-451为研究对象,进一步分析其下游靶标及涉及的机制通路后,通过体外实验验证miR-451的生物学功能。近几年的研究表明miR-451可通过包裹于外泌体中影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,因此我们试验性在的在宫颈癌亲代及其耐药细胞株中研究了miR-451在预测宫颈癌化疗敏感性中的作用。本研究为寻找预测宫颈癌患者特异性治疗靶点及预测宫颈癌患者化疗敏感性的标志物提供理论及实验室依据,并为以外泌体作为治疗载体治疗宫颈癌提供了新的治疗思路。第一部分宫颈癌相关差异miRNA生物信息学研究目的:研究整理分析GEO中公共数据库中储存的宫颈癌miRNA数据集,筛选差异表达的miRNA基因,并对差异表达基因进行靶基因预测,ce RNA网络构建,GO功能注释,KEGG功能富集分析及PPI网络分析。为后续实验探索宫颈癌的发生进展的分子机制提供理论基础。方法:本研究以宫颈癌的相关芯片数据集作为研究对象,其中以正常样本作为对照,从GEO数据库中筛选出miRNA数据集GSE30656为研究对象,通过limma和affy包对质控后的RNA表达谱进行差异表达分析。在Pubmed中对差异miRNA逐个筛选,经过通读文献,对宫颈癌相关文献中已被证实及研究过的miRNA予以去除,确定下一步研究的目标miRNA。再针对目标miRNA进行靶基因预测,DAVID软件进行GO功能注释,KEGG功能富集分析,STRING在线数据库进行PPI网络分析。结果:1)本研究在宫颈癌中发现50个差异表达的miRNA,其中表达上调的21个,表达下调的29个。结合文献筛选,选取miR-451作为下一步实验验证的基因。2)针对于miR-451筛选到的m RNA基因进行功能富集分析,发现差异表达基因主要参与氮化合物代谢过程的调控、蛋白磷酸化过程的调控、RNA代谢过程的调控、细胞蛋白质代谢的调节等生物学功能。KEGG通路富集分析发现差异表达的基因主要集中在PI3K/AKT通路及m TOR等信号通路。结论:1)成功筛选出宫颈癌中差异表达的50个miRNA,包括21个上调的miRNA和29个下调的miRNA;结合文献检索筛选检出miR-451作为后续研究基因;2)对miR-451进行了lnc RNA-miRNA-m RNA ce RNA网络,并分析对其下游m RNA靶基因进行了GO功能富集分析与KEGG通路分析,以及对差异m RNA进行了PPI蛋白互作网络分析,为后续进行实验验证提供了基于宫颈癌组织测序数据分析的理论依据。第二部分:miR-451通过靶向MIF抑制宫颈癌细胞增殖迁移等功能目的:探讨miR-451通过靶向MIF对宫颈癌细胞增殖、凋亡、周期、侵袭及迁移能力的影响及其分子机制。方法:在Si Ha细胞中转染miR-451 NC/mimic,Ca Ski细胞中转染miR-451 NC/inhibitor后,CCK-8法检测miR-451对细胞增殖的影响;流式细胞术检测miR-451对细胞凋亡及周期的影响;细胞划痕实验检测miR-4

摘要： 主编:丁明孝王喜忠张传茂陈建国出版:高等教育出版社出版时间:2020年5月ISBN:978-7-04-047157-1定价:89.00元内容提要《细胞生物学》(第5版)是一本全彩色印刷、图文并茂的教材。全书共16章,内容包括绪论、细胞生物学研究方法、细胞质膜、物质的跨膜运输、细胞质基质与内膜系统、蛋白质分选与膜泡运输、线粒体、叶绿体、细胞骨架、细胞核与染色质、核