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关键词： 组蛋白去甲基化酶JMJD8   AKT   翻译后修饰   细胞增殖   DNA损伤修复   肿瘤侵袭和转移  

摘要： JMJD8是含有JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶家族成员之一,该家族成员可对多个组蛋白或非组蛋白赖氨酸位点进行去甲基化修饰,广泛参与细胞内各种生物学进程。过去的研究表明,JMJD8定位于内质网,可与PKM2作用参与调控细胞代谢和血管生成。尽管JMJD8在相关生物学进程中起着重要的作用,但其具体的分子作用机制还尚未报道。本研究以JMJD8介导的AKT相关信号通路为核心,首次揭示了 JMJD8作为一个负调控因子,参与肿瘤细胞增殖、DNA损伤修复以及侵袭和转移多个生物学过程。第一部分:JMJD8参与调控肿瘤细胞增殖和辐射损伤修复DNA双链断裂损伤被认为是辐射导致的最重要的染色质损伤。在本研究中,我们发现在肿瘤细胞中抑制JMJD8的表达促进细胞增殖,并且通过增强非同源末端连接修复关键蛋白Ku70和Ku80的表达减弱电离辐射或化疗药物依托泊苷诱导的DNA双链断裂损伤水平。进一步研究发现,JMJD8通过AKT/NF-κB/COX-2信号通路介导Ku70/Ku80的表达,调控电离辐射和化疗药物诱导的DNA双链断裂损伤修复。表明JMJD8可能是提高肿瘤放化疗敏感性的药物靶点。第二部分:JMJD8影响肿瘤细胞的侵袭和转移上皮间充质转化(EMT)可以诱导肿瘤细胞发生侵袭和转移,是肿瘤恶性化的标志性事件之一。在本研究中,我们发现抑制JMJD8的表达诱导AKT及下游GSK3β的磷酸化激活,提高β-catenin Ser552/Ser675磷酸化水平,降低β-catenin Thr33/37/Ser41磷酸化水平,进而增强β-catenin在细胞中的累积和入核。β-catenin的表达可以激活下游靶蛋白MMP9,c-Myc的表达,促进上皮间充质转化,并最终导致肿瘤细胞的侵袭和转移。我们的工作发现并阐述了 JMJD8通过AKT/GSK3β/β-catenin信号通路调控肿瘤细胞上皮间充质转化的分子机制,解析了 JMJD8影响肿瘤侵袭和转移的新途径,为肿瘤的治疗提出一个新的思路和潜在的生物活性标记物。第三部分:JMJD8调控AKT翻译后修饰影响肿瘤细胞相关生物学进程组蛋白甲基化修饰相关的酶不仅可以调控组蛋白的甲基化水平,也可以参与非组蛋白的甲基化修饰。在本研究中,我们发现JMJD8通过调控SETDB1介导的AKT甲基化修饰影响AKT的膜定位和激酶活性。在JMJD8敲低细胞中,由SETDB1介导的AKT1 K142的三甲基化修饰可以促进AKT膜转运,进而促进PDK1与甲基化的AKT1的结合并诱导其磷酸化激活。此外,三甲基化修饰的AKT K142可以招募JMJD2B,JMJD2B作为正调控因子,促进AKT介导的β-catenin磷酸化修饰。本研究表明,JMJD8通过调控AKT翻译后修饰影响肿瘤相关生物学进程,指出组蛋白去甲基化酶JMJD8作为一个潜在靶向位点,用于肿瘤治疗的重要意义。上述研究结果揭示了组蛋白去甲基化酶JMJD8在细胞增殖、DNA损伤修复和肿瘤侵袭与转移过程中的重要作用,为肿瘤的早期诊断和治疗提供新的标记物和药物靶点。

关键词： 生物信息学   STAT3   Grim19   GO功能注释   KEGG通路富集分析   卵巢肿瘤   STAT3   Grim19   转移   Grim19   STAT3   卵巢癌   增殖   迁移  

摘要： 卵巢癌病死率高,起病隐匿、疾病进展快,复发和转移是卵巢癌临床治疗难题,患者预后较差。研究表明,信号转导与转录激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT3)参与多种肿瘤的疾病进展,是调控肿瘤微环境的关键作用因子,在多种癌症中组成性激活,影响诸如细胞增殖、凋亡、肿瘤干细胞生成、上皮-间质转化等多种生物学过程。但其作用机制和有效的靶点有待进一步研究。维甲酸-干扰素诱导死亡相关基因19(the genes-associated with retinoid-interferon induced mortality 19,Grim19)是最近研究发现的一种肿瘤抑制基因,作为线粒体复合体I的组成亚基参与能量代谢,同时有研究表明Grim19特异作用于STAT3,引起STAT3转录活性负调节,减缓STAT3磷酸二聚体的形成,减弱STAT3的凋亡抑制作用,从而调控肿瘤细胞凋亡、增殖等多种细胞生物学过程,但其作用机制尚不明确。本研究通过生物信息学方法筛选与STAT3、Grim19相关的基因及作用信号通路,研究STAT3、Grim19在上皮性卵巢癌中的表达、定位以及与临床病理因素之间的关系,探索STAT3、Grim19对卵巢癌细胞功能的影响。第一部分STAT3、Grim19在卵巢癌疾病中相关基因预测和作用信号通路的生物信息学分析目的应用生物信息学方法检索STAT3、Grim19的基本信息,分析两者的相关基因,并对相关基因进行功能注释与信号通路富集。方法利用NCBI、UCSC、Uni Prot数据库检索STAT3、Grim19的基本信息。使用Pubmed数据库检索包含STAT3、Grim19的相关文献资料。利用GEPIA、String在线工具分析STAT3、Grim19之间的关联性和互作关系。下载肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中包含STAT3、Grim19表达水平和完整随访资料的卵巢浆液性囊腺癌(Ovarian Serous Cystadenocarcinoma,OV)临床病例资料并做生存分析。通过整理TCGA数据库临床病例资料,利用在线工具Linked Omics筛选相关基因。利用Omicshare在线软件对相关基因进行GO功能注释富集分析以及KEGG信号通路富集分析。结果STAT3、Grim19表达水平具有组织学特异性,STAT3在多种恶性肿瘤疾病中上调,Grim19在多种恶性肿瘤疾病中下调,且二者呈负相关。TCGA临床数据库病例资料生存分析结果显示STAT3高表达组的中位生存时间与低表达组相比无明显差异(1354天vs 1321天,P>0.05);Grim19高表达组的中位生存时间高于低表达组(1483天vs 1336天,P<0.05)。在筛选到的6426个基因中,2785个基因与STAT3具有相关性(P<0.05),其中相关系数最高的基因为DNAAF2;4960个基因与Grim19具有相关性(P<0.05),其中相关系数最高的基因为NDUFB7。GO功能注释富集分析结果显示,STAT3主要涉及的生物学过程为细胞过程、单一生物过程、代谢过程、刺激反应等;主要涉及的分子功能为结合、催化活性、信号转导活性等;主要涉及的细胞组分为细胞区域、细胞质和细胞膜等。Grim19主要涉及的生物学过程为细胞过程、代谢过程、细胞组分的组织或合成等;主要涉及的分子功能为结合、催化活性、结构分子活性等;主要涉及的细胞组分为细胞区域、细胞质和细胞器。KEGG通路富集分析结果显示,STAT3主要参与的细胞过程为分解和代谢,作用机体系统为免疫系统和内分泌系统,涉及细胞信号转导功能,在多种传染系统疾病与恶性肿瘤中作用显著;Grim19信号通路在神经退行性疾病、内分泌和恶性肿瘤疾病过程中作用明显,参与如能量代谢、核苷酸代谢等多种生物学代谢过程(P<0.05)。结论Grim19可能通过与STAT3相互作用调控卵巢癌疾病进展;STAT3可能通过多种信号通路介导卵巢癌发生发展。第二部分STAT3、Grim19在上皮性卵巢癌组织中的表达与临床意义目的检测STAT3、Grim19在上皮性卵巢癌组织中的表达及与临床病理因素的关系。方法收集2013-2018年在广西医科大学附属肿瘤医院经手术治疗切除的卵巢组织样本,采用免疫荧光法观察两者在细胞中的定位;免疫组织化学法检测不同卵巢组织中Grim19、STAT3蛋白的表达水平并分析其与临床病理因素及预后的关系。结果免疫组化法显示STAT3在正常卵巢组织中相对表达水平最低(31.40±1.25),其次为良性卵巢肿瘤(40.58±1.52)与交界性卵巢肿瘤(52.07±3.02),在上皮性卵巢癌中相对表达水平较高(68.08±1.20);Grim19在上皮性卵巢癌中相对表达水

关键词： miRNA   Cripto-1   宫颈癌   增殖   凋亡  

摘要： 宫颈癌(cervical cancer)作为女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在女性恶性肿瘤中排名第二。目前针对宫颈癌仍是手术和放化疗联合治疗,但是宫颈癌患者预后及死亡率并没有得到明显改善。因此,寻找高效特异的靶分子用于宫颈癌的早期诊断和靶向治疗具有重要意义。原癌基因Cripto-1是表皮生长因子EGF/CFC家族的一员。有研究表明,Cripto-1在多种宫颈癌组织中高表达,并且Cripto-1对宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化均具有促进作用。Cripto-1在宫颈癌的发生发展过程中发挥重要作用,因此Cripto-1可能成为宫颈癌诊断及治疗的有效靶点。目前,对Cripto-1的表达调控的研究主要集中在启动子区或几个转录因子的转录调控上,但在转录水平之外的调控方面鲜有报道。本研究从转录后水平分析在宫颈癌细胞中Cripto-1的表达调控及其分子机制。我们利用生物信息学软件预测了与Cripto-1 m RNA 3’UTR结合的miRNAs及其结合位点。通过荧光素酶报告基因方法进一步筛选确认了靶向Cripto-1 m RNA 3’UTR的miRNAs,并接下来探讨了miRNAs对Cripto-1高表达的宫颈癌细胞生物学特性的影响,具体如下。1.靶向Cripto-1 m RNA 3’UTR的miRNAs的预测及鉴定我们利用Target Scan、mi RBase Targets和mi RDB生物信息学软件预测了靶向Cripto-1 m RNA 3’UTR的潜在miRNAs序列,之后利用Cripto-1 m RNA 3’UTR驱动的荧光素酶报告基因方法筛选出能够调控Cripto-1表达的三种miRNAs,分别是mi R-3133、mi R-3929和mi R-5093。接下来采用-q RT-PCR和western blot的方法检测了这三种miRNAs对宫颈癌细胞中的Cripto-1基因m RNA和蛋白水平的表达的抑制作用。***靶向调控Cripto-1表达的验证首先我们构建了野生型Cripto-1 m RNA 3’UTR和突变型3’UTR的荧光素酶报告载体,将其转染入细胞后检测其对荧光素酶活性的影响。结果显示,mi R-3133与mi R-3929显著降低了转染野生型载体的细胞中萤光素酶的活性,而对转染突变体的细胞中萤光素酶的活性没有影响。之后,我们将miRNAs的抑制剂转染入Cripto-1低表达的人宫颈上皮细胞H8中,通过western blot和q RT-PCR检测其对Cripto-1表达的影响。western blot结果显示,三种miRNAs抑制剂均刺激了Cripto-1蛋白的表达。q RT-PCR结果显示,mi R-3929和mi R-5093抑制剂促进了Cripto-1 m RNA的表达;而mi R-3133抑制剂则无此作用。最后将三种miRNAs分别与Cripto-1真核表达载体同时转染入He La细胞,通过q RT-PCR和western blot检测其对Cripto-1表达的影响。结果显示,过表达的Cripto-1蛋白并未受miRNAs的影响。此结果进一步证明了mi R-3133、mi R-3929及mi R-5093是通过靶向Cripto-1 m RNA的3’UTR来调节其表达。。***对Cripto-1高表达的宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响为了检测这三种miRNAs的生物学功能,我们首先用MTT的方法分析了它们对高表达Cripto-1的人宫颈癌细胞活力的作用。结果显示,mi R-3133、mi R-3929及mi R-5093均能抑制人宫颈癌细胞的活力。细胞活力的降低一般是由于细胞增殖抑制或凋亡增加所引起,因此,我们首先检测了miRNAs对细胞增殖的影响。Ki67免疫荧光染色和Brd U掺入实验的结果显示,mi R-3133、mi R-3929及mi R-5093均能显著抑制人宫颈癌细胞的增殖。细胞周期相关蛋白检测结果表明,这三种miRNAs能够上调宫颈癌细胞中CDK2和p27蛋白的水平,下调cyclin E蛋白的水平;采用流式细胞术检测发现,这三种miRNAs均能导致宫颈癌细胞-周期阻滞在G2/M期,进而抑制宫颈癌细胞的增殖。之后我们又检测了三种miRNAs对细胞凋亡的影响。DAPI染色及流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,这三种miRNAs均能够诱导宫颈癌细胞发生凋亡。同时,我们检测了细胞凋亡相关蛋白的表达,这三种miRNAs的作用增加了细胞内Cleaved caspase-9和Cleaved caspase-3的水平,同时下调了Bcl-2/Bax蛋白的比值,因此,提示我们这三种miRNAs均可通过线粒体途径诱导宫颈癌细胞发生凋亡。***对宫颈癌细胞体内成瘤能力的影响为了检测m

关键词： Ferumoxytol   PLL-Ferumoxytol   胰岛β细胞   胰岛移植  

摘要： 糖尿病是公共卫生中最主要的问题之一。尽管胰岛素治疗改善了糖尿病的短期疗效,然而糖尿病患者持续出现一般性和破坏性的并发症,目前克服这些并发症的唯一选择通常是胰岛移植,这种治疗可以保持恒定的葡萄糖稳态,而不需要外源性胰岛素,但胰岛移植依然面临胰岛丢失、β细胞功能紊乱等挑战。新方法的开发是必要的,不仅是为了控制代谢不规则,还可能增加形成的β细胞数量或减少细胞死亡。作为确定更好的糖尿病治疗方法的一个原因,科学家们要求获得有效的胰岛移植的方法。超顺磁性氧化铁纳米粒(SPIONs)是目前应用最广泛的生物医用材料,已被用于监测胰岛移植和功能。据我们所知,很少有研究集中在SPIONs增强胰岛β细胞功能的生物学效应上。研究将多聚赖氨酸(Poly-L-lysine,PLL)与本课题组自行制备的超顺磁性氧化铁纳米粒子Ferumoxytol结合,利用PLL修饰的Ferumoxytol标记小鼠胰岛β细胞系MIN6细胞,初步探索其标记MIN6细胞的可行性、标记效率,以及生物安全性等。为未来寻找安全、有效的胰岛移植治疗糖尿病的示踪技术奠定基础。培养小鼠胰岛β细胞系MIN6,使用PLL修饰的Ferumoxytol和Ferumoxytol与细胞共孵育标记细胞。采用CCK-8法检验MIN6细胞的活力与增殖。肌动蛋白丝和细胞核染色观测细胞内部细胞骨架的形貌。普鲁士蓝染色和透射电镜观察被标记的细胞内铁颗粒的分布情况。使用葡萄糖刺激胰岛素释放试验对标记后MIN6细胞的胰岛素分泌功能进行检验和评估。研究结果显示,未标记组、Ferumoxytol和PLL-Ferumoxytol组之间,MIN6细胞的细胞形貌无明显差异。与200μg/m L PLLFerumoxytol共孵育24h后,细胞的增殖倍数有显著增强。其余组别之间细胞活性及增殖无明显差异,且活/死荧光染色结果显示,不同组别的细胞均维持了较高的活性。F-肌动蛋白染色结果显示,标记后的细胞骨架特性未有显着差异。普鲁士蓝染色结果显示,PLL-Ferumoxytol标记组细胞胞质内呈现蓝色铁颗粒,TEM结果进一步验证了铁颗粒的分布情况。同时,葡萄糖刺激胰岛素释放试验结果显示,添加纳米粒子对MIN6细胞胰岛素释放功能无显著影响。制备的PLL-Ferumoxytol具有良好的生物相容性和超顺磁性,能够有效标记小鼠MIN6细胞,对细胞的活性和功能无显著性影响,可以进一步应用于胰岛细胞移植的磁标记物并应用于MRI活体示踪,为未来寻找安全、有效的胰岛移植治疗糖尿病的示踪技术奠定基础。

关键词： RhoGDI2   膀胱癌   hsa-miR-375   细胞生物学特性  

摘要： 目的:筛选并鉴定靶向调控膀胱癌RhoGDI2基因的miRNA。方法:首先通过The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库下载膀胱癌的基因表达和miRNA测序数据以及甲基化数据,在线网站预测和RhoGDI2具有结合位点的miRNA。然后使用TCGA数据库的膀胱癌数据分别进行miRNA-m RNA和甲基化-m RNA的关联分析,找出RhoGDI2可能的调控方式;构建带有RhoGDI2序列的质粒载体并和预选miRNA的模拟物共转染入293T细胞中进行双荧光素酶实验,检测他们的分子结构上的结合能力;western blot检测4种不同侵袭性的膀胱癌细胞中的RhoGDI2和RAC1的蛋白表达,以及对比不同RhoGDI2表达下的膀胱癌细胞生物学行为。结果:通过初步的生物信息学分析,我们认为miRNA的转录后调控更可能是RhoGDI2的潜在调控方式,并初步筛选出了hsa-miR-34c-5p、hsamiR-375作为预选的miRNA;在双荧光素酶实验中,RhoGDI2的3’UTR质粒和hsa-miR-375 mimic共转染后与其他组相比萤火虫荧光活性明显下降(P<0.05),两者之间存在结合位点。hsa-miR-34c-5p与RhoGDI2之间未检测到存在结合位点;我们发现在4种膀胱癌细胞中,RhoGDI2和RAC1的蛋白表达存在显著的正相关;RT4和SW780的RhoGDI2表达明显高于T24和UMUC3。同时,RT4和SW780在细胞增殖和侵袭能力上都显著更弱于T24和UMUC3。结论:RhoGDI2表达较高的患者会拥有更好的预后。相比于甲基化调控,膀胱癌中RhoGDI2的表达下降更可能是miRNA的转录后调控造成的。双荧光素酶实验证实了hsa-miR-375与RhoGDI2之间具有分子结构上的结合能力。RhoGDI2和RAC1拥有较强的正相关性,并且高表达的RhoGDI2的膀胱癌细胞显著具有更低的细胞增殖和侵袭能力。

关键词： 肝再生磷酸酶-3抗体   紫杉醇   A549   PRL-3   PI3K   P-AKT  

摘要： 目的:探讨肝再生磷酸酶-3抗体(Phosphatase in Regenerating Liver-3antibody,PRL-3抗体)联合紫杉醇(paclitaxel,PTX)对人肺腺癌A549细胞株的增殖抑制、迁移、凋亡等生物学特征的影响及其对PRL-3、PI3K、P-AKT的影响,并探讨可能的机制,为肺癌临床上的药物治疗提供新的思路和依据。方法:(1)培养人肺腺癌A549细胞:在RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)中加入A549细胞株,置于培养箱内培养,取对数生长期的A549细胞用于后续实验。(2)测定不同浓度PRL-3抗体处理A549细胞24h后各组的OD值,计算各组细胞增殖抑制率及PRL-3抗体的IC50值:在96孔板上接种对数期的A549细胞,温育后分别加入不同浓度的PRL-3抗体(50、100、150、200、250 ng/ml),继续培养24h。后使用CCK-8法检测各PRL-3抗体组的吸光光度值(OD值),并计算各组的增殖抑制率及半数抑制浓度(IC50)。选择IC50浓度作为后续实验的药物浓度。(3)实验分组及处理:实验分为4组(对照组、PRL-3抗体组、紫杉醇组、PRL-3抗体+紫杉醇组)。各组处理方法:(1)对照组:加入培养液。(2)PRL-3抗体组:加入IC50浓度的PRL-3抗体。(3)紫杉醇组:加入IC50浓度的紫杉醇。(4)PRL-3抗体+紫杉醇组:加入IC50浓度的PRL-3抗体+IC50浓度的紫杉醇。后将各组按照不同干预时间(24h、48h、72h)进行干预。然后使用CCK-8法测定各组OD值,计算各组细胞增殖抑制率,再比较各组间差异。并选择增殖抑制率最佳时间点(72h)作为后续实验的干预时间点。(4)测定各组细胞凋亡情况:按照上述分组及处理方式处理各组A549细胞72h后,使用流式细胞术测定各组细胞凋亡情况,并比较各组间差异。(5)测定各组细胞迁移能力:按照相同分组及处理方式处理细胞72h后,使用Transwell法测定各组细胞迁移能力,并比较其组间差异。(6)蛋白免疫印迹杂交法(Western Blot)检测各组中PRL-3、PI3K、p-AKT蛋白的表达水平:按先前实验分组及处理,处理细胞72h,后采用Western Blot法测定各组中PRL-3、PI3K、p-AKT蛋白表达水平。并比较组间PRL-3、PI3K、p-AKT蛋白表达的差异。结果:(1)CCK-8检测A549细胞在不同浓度PRL-3抗体作用24h后的OD值,随着PRL-3抗体浓度的增加,细胞的增殖抑制率呈上升趋势,并表现出浓度依赖性(P<0.05),差异有统计学意义;(2)CCK-8法检测PRL-3抗体组(IC50)、PTX组(IC50)各单药及联合用药组分别作用于A549细胞不同时间(24h、48h、72h)的增殖抑制率,发现随着时间的延长,A549细胞的增殖抑制率逐渐升高,呈时间依赖性(P<0.05),差异有统计学差异;并发现PRL-3抗体与紫杉醇联合用药组作用于A549细胞的增殖抑制率优于单药组(P<0.05),差异有统计学意义;(3)流式细胞术检测各组细胞凋亡率,得出联合用药组作用A549细胞的凋亡率(50.80±0.80%)优于PRL-3抗体组凋亡率(31.39±0.92%)、PTX组凋亡率(32.18±0.93%)(P<0.05),差异有统计学差异;(4)使用Transwell法检测各组的细胞迁移率,得出PRL-3抗体与紫杉醇联合用药组作用A549细胞的迁移率(52.60±0.40%)明显低于PRL-3抗体组迁移率(101.20±1.20%)、PTX组迁移率(99.60±1.20%)(P<0.05),差异具有统计学差异;(5)Western Blot法检测示:PRL-3抗体(164 ng/ml)作用A549细胞72h后,可引起PRL-3(0.38±0.06)蛋白表达的下调,PI3K(0.35±0.01)蛋白表达的下调,P-AKT(0.33±0.05)蛋白表达的下调;PTX(40ug/ml)作用A549细胞72h后,可引起PRL-3(0.34±0.04)表达下调,PI3K(0.31±0.01)表达下调,P-AKT(0.29±0.05)表达下调;而PRL-3抗体联合紫杉醇作用A549细胞72h后,引起PRL-3(0.11±0.04)表达下调,PI3K(0.15±0.03)表达下调,P-AKT(0.14±0.07)表达下调,其表达水平联合用药组较单药组差异显著(P<0.05),有统计学意义。结论:(1)PRL-3抗体在一定浓度范围能抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移,诱导细胞凋亡,且呈浓度依赖性。(2)PRL-3抗体联合PTX可显著抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移,诱导细胞凋亡,两药联合组对肺癌A549细胞的作

关键词： 干细胞生物学   教材建设  

摘要： 教材建设是高校教学的重要环节。近年来,同济大学生命科学与技术学院以干细胞研究为特色导向,结合学院高层次师资力量,建立了较为系统的专业课程链,但仍缺乏与学生课程及学科发展配套的干细胞生物学相关教材。为此,聚集学院的人才储备力量编写一本适用于生命科学相关专业学生及科研/临床工作者的干细胞生物学教材,在介绍干细胞各自领域研究历史的基础上,教材建设将侧重创新性和前沿性的知识阐述。

关键词： 卵巢癌   miR-30b-3p   生物学功能   CTHRC1   靶基因  

摘要： 目的:卵巢癌是女性常见的生殖系统恶性肿瘤，其死亡率居所有恶性肿瘤前列。随着医疗技术的不断进步，卵巢癌的治疗手段有了一定程度的提高，以手术切除联合化疗的综合治疗方式对于初治患者的有效率可达到70％以上，但由于临床上缺乏卵巢癌早期诊断的敏感指标以及患者对化疗药物敏感性的降低，使得卵巢癌患者的5年生存率仍不足40％，预后较差。因此，寻找新的卵巢癌发生发展过程中的分子标志物，对于临床上提高卵巢癌诊治效果，延长卵巢癌患者的生存周期具有重要意义。miRNA是一类广泛存在于真核生物中的小分子非编码单链RNA，其通过作用特定靶基因mRNA的3'UTR抑制其翻译过程，从而调控下游靶基因的表达。miR-30b-3p是miR-30家族成员之一，多项研究显示其参与了多种恶性肿瘤的发生和进展过程，且在不同的恶性肿瘤其扮演的角色不同，但目前尚少有研究关于miR-30b-3p在卵巢癌中的调控作用及调控机制。本研究旨在探讨miR-30b-3p在卵巢癌中的表达，分析miR-30b-3p表达的临床意义，进而从细胞水平和动物体内水平分别研究miR-30b-3p对卵巢癌细胞生物学功能的调控作用，并初步探讨其可能的调控机制。　　方法:(1)收集72例卵巢癌组织及正常卵巢组织38例，通过实时荧光PCR法检测组织中miR-30b-3p的表达水平，收集卵巢癌患者完整的临床病理资料，采用相关性分析miR-30b-3p表达与各临床病理参数的关系。通过回访的方式收集患者预后信息，采用Kaplan-Meier生存曲线分析miR-30b-3p表达对患者总生存周期(Overall survival，OS)和无病生存期(Disease free survival，DFS)的影响，进而采用Cox回归模型对患者预后的独立危险因素进行单因素和多因素分析。(2)采用实时荧光PCR法检测人卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3、A2780、HO-8910细胞及正常卵巢上皮细胞IOSE80中miR-30b-3p的表达水平。脂质体转染法向SKOV3细胞中转染miR-30b-3pmimics、miR-30b-3pinhibitor及其对照，使miR-30b-3p在卵巢癌细胞中稳定表达上调或下调，采用CCK-8法、细胞克隆形成实验、细胞划痕实验和Transwell法检测各组细胞的增殖、迁移和侵袭能力，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况，并采用Westernblot法检测细胞凋亡相关蛋白和细胞EMT过程相关蛋白的表达水平。(3)通过生物信息学软件Targetscan、miRanda和miRDB预测miR-30b-3p可能的下游靶基因，构建荧光素酶表达载体，采用双荧光素酶法验证miR-30b-3p对靶基因CTHRC1的直接靶向作用，Westernblot法检测过表达miR-30b-3p后卵巢癌细胞中CTHRCl的表达水平。采用免疫组化法检测临床卵巢癌组织标本中CTHRC1的表达情况，对miR-30b-3p的相对表达水平和CTHRC1的免疫组化进行Spearman相关性分析。进而在miR-30b-3pmimics组细胞中进一步过表达CTHRC1，采用CCK-8、流式细胞术和Transwell法检测CTHRC1对miR-30b-3p调控功能的逆转作用。(4)采用慢病毒感染SKOV3细胞，获取稳定过表达miR-30b-3p的卵巢癌细胞，通过皮下注射细胞悬液的方式建立卵巢癌皮下裸鼠移植瘤模型，定期观察裸鼠移植瘤成瘤情况并测量移植瘤体积。在接种的第30天处死裸鼠，剥离完整的瘤体，称量瘤体的重量，采用qRT-PCR和Westernblot法检测移植瘤组织巾miR-30b-3p和CTHRC1的表达情况。进而采用免疫组化检测瘤体组织中CTHRC1的表达，对miR-30b-3p和CTHRC1的表达进行相关性分析。　　结果:(1)实时荧光定量PCR结果显示，miR-30b-3p在卵巢痛组织中表达显著下调，与正常组织相比差异有统计学意义(p＜0.05)，相关性分析结果显示，miR-30b-3p与卵巢癌患者的FIGO分期、肿瘤细胞分化程度和是否发生淋巴结转移具有显著相关性(p＜0.05)，而与患者年龄、组织学类型、肿瘤大小、腹水无显著相关性(p＞0.05)。Kaplan-Meier生存曲线结果显示，miR-30b-3p表达与患者的生存周期具有显著相关性，miR-30b-3p高表达者的总生存周期和无病生存期均显著长于miR-30b-3p低表达者;Cox回归分析结果显示，FIGO分期和miR-30b-3p表达水平为卵巢癌患者预后的独立危险因素。(2)miR-30b-3p在卵巢癌细胞系中表达水平显著低于正常卵巢上皮细胞(p＜0.05)。在卵巢癌细胞SKOV3中过表达miR-30b-3p后，细胞增殖活性、迁移和侵袭能力显著降低，而敲低miR

关键词： 生物细胞学   教育改革   必要性   意义   策略  

摘要： 在教育改革的大背景下,细胞生物学课程教学呈现出多样化发展的趋势,成为学科提高教学质量的重要手段。本文以大学细胞生物学教育改革为研究对象,分析教育改革的必要性与意义,并提出相关改革策略,以期指导应用于教学实践。

关键词： 乳腺癌   LDH-C4   预后   MCF-7  

摘要： 目的:1.研究乳酸脱氢酶C4(lactate dehydrogenase C4,LDH-C4)蛋白在乳腺癌组织中的表达,探讨LDH-C4对乳腺癌预后判断的价值。2.探讨LDH-C4表达上调对MCF-7乳腺癌细胞中的生物学影响,并对相关分子机制进行初步研究。方法:1.通过免疫组织化学分析158例乳腺癌石蜡组织中LDH-C4蛋白在的表达情况。分析乳腺癌不同临床病理参数(临床分期、病理类型、分子分型等)下LDH-C4蛋白表达的差异。对随访资料进行Cox回归模型,研究LDH-C4蛋白在乳腺癌预后判断的临床价值。2.通过慢病毒载体将外源LDHC基因导入MCF-7乳腺癌细胞中,通过稀释法结合绿荧光蛋白表达筛选LDH-C4阳性表达的单克隆细胞系。通过平板克隆、CCK-8细胞增殖、细胞划痕、Transwell小室等细胞生物学实验,研究LDH-C4表达上调对MCF-7细胞生物学行为的影响;Western blot法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关分子,探讨LDHC基因上调对乳腺癌MCF-7细胞生物学影响的可能机制。结果:1.158例乳腺癌石蜡组织切片免疫组化染色,LDH-C4蛋白染色集中在细胞质中,呈淡棕色到深棕色,阳性率为91.8%(145/158),其中低表达(-/+)和高表达(++/+++)分别为41.8%(66/158)、58.2%(92/158)。经卡方检验,乳腺癌临床分期晚、腋窝淋巴结转移率高,患病年龄低者LDH-C4呈高表达(P<0.05);Kaplan-Meier法进行生存分析并经Log-rank检验结果显示,乳腺癌LDH-C4高表达者预后差(P=0.035);Cox回归分析显示临床分期(P=0.000)和LDH-C4表达水平(P=0.002)是乳腺癌预后的独立因素。2.通过慢病毒感染成功筛选LDH-C4过表达的单克隆化的乳腺癌MCF-7细胞系;细胞学实验结果显示,LDH-C4过表达可增强乳腺癌MCF-7侵袭和迁移能力,而对细胞生长增殖无显著影响;免疫印迹法初步显示,过表达LDH-C4可上调乳腺癌MCF-7细胞中AKT和mTOR蛋白的表达。结论:***-C4在乳腺癌组织中阳性表达率高,其表达与临床分期、腋窝淋巴结转移相关;高LDH-C4蛋白水平预示乳腺癌不良预后。2.过表达LDH-C4可增强MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移能力,其机制可能与AKT/mTOR细胞信号通路的激活有关。