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关键词： 疫情防控   方舱医院   中国生物物理学会   中国针灸学会   中国康复医学会   中医药防治   细胞生物学  

摘要： 中国生物物理学会会员组队赴武汉"方舱医院"开展检测工作近日,中国生物物理学会多名会员组成的中国医学科学院病原生物学研究所检测团队肩负起武汉客厅方舱医院的核酸检测工作。由于新型冠状病毒感染肺炎患者的临床表现多样,病毒核酸检测成为主要确诊方式。检测团队同时带去了移动P3实验室,通过荧光定量的PCR法独立完成所有患者住院和出院前的病毒核酸检测。

关键词： 《细胞生物学》   实验教学   课程教学改革   人才培养  

摘要： 在生物学相关专业中,《细胞生物学》属于核心课程,课程教学还应达到培养高素质专业人才的目标。基于此,本文对课程教学存在的问题展开了分析,从实践课程增设、教学内容更新、教学方法优化和人才队伍建设四个方面提出了课程改革措施,然后对课程教学改革实践方法进行了探讨,为关注这一话题的人们提供参考。

关键词： 混合式教学   学习评价   医学细胞生物学  

摘要： 本研究从混合式教学理念出发,设计了符合《医学细胞生物学》课程特点、与混合式教学框架相契合的学习评价体系,并开展了实践。结果表明,该评价体系能较好的嵌入混合式教学框架,以多样化的形式开展形成性评价与终结性评价并体现成果导向教学理念,提高课程教学质量。

关键词： 胶质瘤干细胞   EZH2   Notch1  

摘要： 目的:脑胶质瘤是最常见的神经上皮细胞肿瘤,由于其发病率高、预后不良,一直是基础和临床研究的热点。近年提出胶质瘤干细胞(Glioma stem cells,GSC)理论已经被大多数学者认可,理论认为胶质瘤干细胞是实体肿瘤中的小部分具备干细胞特性的“种子”,虽然胶质瘤干细胞仅占极少数,且与构成肿瘤主体的相对分化的肿瘤细胞不同,但因其干细胞特性,包括无限生长、不对称细胞分裂以及肿瘤多向分化潜能,是驱动肿瘤发生发展和侵袭迁移,以及放射治疗和药物化疗抵抗的根源。组蛋白赖氨酸甲基转移酶(Enhancer of zeste homolog 2,EZH2)基因编码的EZH2蛋白是多梳抑制复合物 2(Polycomb repressive complex 2,PRC2)的一个催化亚基,PRC2可通过EZH2使赖氨酸27上组蛋白H3(H3K27me3)的三甲基化来维持靶基因的转录抑制,从而发挥作用。EZH2过度表达已被报道在许多侵袭性肿瘤中,包括来自头颈部,皮肤,肾脏,肺,膀胱和肝脏的肿瘤,并且在这些肿瘤中,EZH2的表达增加与预后相关。本研究检测EZH2在人脑低、高级别胶质瘤组织标本中的表达差异;并研究胶质瘤干细胞中EZH2的作用,探讨EZH2对胶质瘤干细胞干细胞特征的维持以及侵袭特性的作用,了解EZH2与Notchl通路之间的相互关系,以此为理论依据发掘胶质瘤潜在的分子治疗靶点。方法:1.通过对常用肿瘤数据库基因表达交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)中370例标本和中国脑胶质瘤基因组图谱(Centre for Global Geostrategic Analysis,CGGA)中228例标本的数据进行分析,了解在人脑胶质瘤组织及非瘤人脑组织中EZH2的表达情况,EZH2表达量和胶质瘤患者预后的关系以及不同WHO分级的胶质瘤中EZH2的表达情况。2.通过Western blot和定量PCR(qRT-PCR)检测本科室收集10例非瘤脑组织和33例胶质瘤组织EZH2的表达量,分析并验证EZH2表达量与胶质瘤预后的影响;3.通过EZH2干扰RNA(siRNA)靶向下调U87、SHG-140来源的胶质瘤干细胞中EZH2的表达后,检测这两种干细胞中自我更新及侵袭能力的变化;4.通过干扰RNA(siRNA)下调U87、SHG-140来源的胶质瘤干细胞中EZH2、Notch1的表达以及通过免疫共沉淀实验后,研究EZH2与Notch1通路之间的相关性;5.使用EZH2特异性甲基转移酶抑制剂GSK126抑制EZH2的表达后,验证EZH2对U87、SHG-140来源的胶质瘤干细胞中EZH2对胶质瘤干细胞自我更新、侵袭能力的影响,同时验证在胶质瘤干细胞中EZH2与Notch1通路的关系。结果:1.在GEPIA分析163例胶质母细胞瘤组织标本和207例非瘤脑组织标本中EZH2的mRNA水平。结合CGGA数据库中228例不同等级胶质瘤患者的数据,得到在人脑胶质瘤组织中EZH2的表达量明显高于非瘤脑组织,并随着WHO等级增加,EZH2的表达增高。同时胶质瘤中EZH2高表达时,胶质瘤患者的生存期较短。2.本研究对43例人脑标本(10例非瘤脑组织和33例胶质瘤组织)进行PCR和Western blot,结果显示EZH2在胶质瘤组织中比非瘤组织表达明显升高,且与胶质瘤的WHO分级呈正相关(P<0.05);3.通过EZH2-siRNA靶向抑制U87和SHG-140胶质瘤干细胞中的EZH2表达后,这两株胶瘤干细胞自我更新能力减低,干细胞分子标记蛋白及Notch1通路相关蛋白表达下(P<0.05);***1-siRNA靶向下调U87和SHG-140来源的胶质瘤干细胞中的Notch1表达后,这两株胶瘤干细胞Notch1通路相关蛋白表达下降,同时干细胞分子标记物表达下降,而EZH2蛋白及H3K27me3蛋白表达无明显下降;5.免疫共沉淀结果显示EZH2活化STAT3后作用于Notch1通路的NICD;***2特异性抑制剂GSK126处理胶质瘤干细胞后发现EZH2、H3K27me3及Notch1通路相关蛋白表达降低,同时两株干细胞系自我更新、增殖及侵袭能力下降。结论:1.在人群中,过表达EZH2与胶质瘤的发生、维持、胶质瘤WHO分级的提升以及胶质瘤患者预后不良密切相关。2.靶向下调EZH2表达可以抑制胶质瘤干细胞自我更新和侵袭能力。***2在胶质瘤干细胞可调控Notch1通路来发挥其生物学特,并且EZH2通过活化STAT3来激活Notch1通路。***126作为EZH2特异性抑制剂可以明显抑制胶质瘤干细胞的自我更新和增殖能力。

关键词： 产科抗磷脂综合征   抗磷脂抗体   中性粒细胞胞外诱捕网   滋养细胞   内皮细胞  

摘要： 研究背景及目的抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)主要临床病史包括血栓形成和/或病理妊娠,临床上将临床病史表现为病理妊娠,没有血栓病史的APS患者称为产科APS(obstetric APS,OAPS)。根据2006年悉尼诊断标准,病理妊娠包括:妊娠10周之前复发性流产、妊娠10周之后胎儿丢失、胎儿生长受限、子痫前期或因胎盘功能不全导致的早产等。实验室诊断包括2次及2次以上检测抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibody,aCL)或抗β 2糖蛋白Ⅰ抗体(anti-β2 glycoprotein I antibodies,a β2GPI)IgM 和/或 IgG 中高滴度阳性,或者狼疮抗凝物(lupus anticoagulant,LA)阳性,2次检测时间间隔至少大于12周。目前对于OAPS常规治疗方法为低剂量阿司匹林联合预防剂量低分子肝素治疗,80%以上OAPS患者可以成功妊娠,但仍有部分患者妊娠期间出现妊娠并发症,提示OAPS发病机制需要进一步探索。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是中性粒细胞活化发挥功能的方式之一,其形成过程称为NETosis。NETs最先在感染性疾病中发现,随着研究进展,NETs与非感染性疾病的关系逐渐显现出来。NETs主要由DNA骨架及附着其上的各种蛋白酶类组成,主要包括髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO),中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE),组织蛋白酶G等。不同的刺激物诱导形成的NETs,其内容物可能不同,不同的内容物具有不同的生物学功能。调控NETs释放的分子机制多样,随刺激物的不同而有所差异。诸多研究表明,NETs的释放依赖呼吸爆发,并与Raf/MEK/ERK等胞内信号通路有关。PI3K/AKT通路被证明在特定免疫复合物刺激NETs形成过程中起重要作用。Hiromichi等研究表明抑制PI3K会同时下调AKT和Raf/MEK/ERK通路。另外,Thiago等人认为,PI3K,AKT及其下游ERK的激活对于依赖活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成的 NETs 非常重要。NETs中的RNA-LL37复合物可以通过作用于Toll样受体8(Toll-like receptor 8,TLR 8)促进细胞因子和趋化因子的释放,并且可以激活中性粒细胞释放更多的NETs,这或许在银屑病发病机制中具有重要作用。在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)中,来自 NETs 的 DNA-LL37 复合物通过TLR9激活多克隆B细胞促进其释放自身抗体,自身抗体与抗原形成免疫复合物,沉积在外周组织,进而引起有害的炎症反应。在动脉粥样硬化性疾病中,胆固醇促进NETs释放,进而使巨噬细胞释放白介素1 β(IL-1β)等细胞因子,并激活Th17细胞。在抗磷脂抗体(antiphospholipid antibodies,aPLs)导致的子痫前期、胎儿生长受限等产科并发症的胎盘组织中发现有大量中性粒细胞聚集,清除体内中性粒细胞之后,抗磷脂抗体介导的产科并发症不再出现。在SLE及子痫前期患者胎盘中,发现绒毛外间隙有大量NETs浸润。胎盘形成障碍是导致复发性流产、子痫前期、胎儿生长受限等产科并发症的主要原因,而滋养细胞及内皮细胞的正常生物学功能对胎盘形成至关重要。抗磷脂抗体可以降低滋养细胞迁移和侵袭能力,亦可以损害内皮迁移及血管形成功能,其发生机制不清楚。因此,本研究拟通过检测早孕期OAPS患者血清中NETs水平的变化观察抗磷脂抗体对NETs生成的影响,进而探索抗磷脂抗体刺激NETs释放的分子机制,并探究抗磷脂抗体诱导的NETs对滋养细胞及内皮细胞的生物学功能影响。实验方法1.样本收集22例早孕期产科抗磷脂综合征患者与22例匹配孕周的早孕期正常妊娠妇女新鲜外周血均来自山东大学附属省立医院。所有志愿者均获得知情同意,研究经医院伦理委员会批准。2.血清中NETs标志物检测利用 Quant-iTTM PicoGreen dsDNA Reagent and Kits试剂盒检测血清中细胞游离DNA的水平,用ELISA法检测血清中NETs标志物MPO-DNA,MPO,NE的水平。3.人外周血中性粒细胞分离使用PolymorphprepTM分离液应用密度梯度离心法,分离人外周血中性粒细胞,台盼蓝染色检测中性粒细胞活性。4.中性粒细胞静息状态下NETs释放实验利用 Quant-iTTM PicoGreen(?)dsDNA Reagent and Kits 试剂盒、活细胞荧光染色检测早孕期OAPS患者及正常妊娠孕妇体内

关键词： 结肠癌   m6A   METTL3   CRISPER/Cas9  

摘要： N6-甲基腺苷（m6A）是发生在腺苷N6位的甲基化,这是真核m RNA上最普遍的内部修饰。而METTL3作为m6A甲基化转移酶的核心成分,介导m6A甲基化的“写入”过程,已被证实在多种癌症中发挥着致癌或者抑癌的作用。可谓METTL3之于癌症是一把双刃剑。而结肠癌作为十大恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康。虽然目前采用手术,化疗以及分子靶向治疗的方法提高了患者治疗效果,但全球每年仍增加超过100万新病例以及大约60万人死亡。为了研究METTL3对人结肠癌HCT-116生物学特性的影响,通过CRISPER/Cas9基因编辑技术,构建METTL3敲低载体,转染结肠癌HCT-116细胞,有限稀释法筛选目的克隆,利用Western Blot筛选建立METTL3敲低细胞系。另外,通过构建METTL3基因过表达的慢病毒载体,将PLVSIN-METTL3、PLVSINEV载体与辅助质粒共转染HEK-293T细胞,进行慢病毒的包装。利用包装好的病毒感染结肠癌HCT-116细胞系,利用Western Blot筛选建立METTL3过表达细胞系。并通过实时定量PCR检测WT-HCT-116细胞系、KD-METTL3细胞系、PLV-METTL3细胞系以及PLV-EV细胞系这四种细胞系的基因表达水平。为了检测METTL3对HCT-116细胞行为学的影响,通过MTT细胞增殖实验发现,对于WT-HCT-116细胞系和KD-METTL3细胞系来说,KD-METTL3细胞系增值能力降低;对于PLV-METTL3细胞系以及PLV-EV细胞系来说,PLV-METTL3细胞系的增殖能力高,综合来说,过表达METTL3促进结肠癌HCT-116细胞增殖。为进一步研究METTL3对于细胞克隆形成能力的影响,采用细胞克隆形成实验,表明METTL3敲低后会抑制细胞的克隆形成。即METTL3下调后会抑制HCT-116细胞的克隆形成能力,也就是说HCT-116细胞的存活力降低。综上所述,METTL3表达下调,抑制结肠癌HCT-116细胞的增殖能力和克隆形成能力,而上调METTL3,则会促进结肠癌HCT-116细胞的增殖,由此初步推断METTL3在人结肠癌HCT-116担任致癌基因的角色。

关键词： 鼻咽癌   SGK1   siRNA   增殖   凋亡   迁移  

摘要： 目的:鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种具有区域性分布以及种族聚集性特征的头颈部恶性肿瘤,好发于我国南方及东南亚地区。鼻咽癌发生于鼻咽部粘膜,其病理类型多为低分化鳞状细胞癌,恶性程度较高,早期即可出现颈部淋巴结转移。鼻咽癌大多对放疗有中度敏感性,以适形调强放疗为主的综合治疗极大地提高了鼻咽癌的局部控制率,却未能显著降低其远处转移率,治疗失败的主要原因是局部复发和远处转移。因此,深入研究鼻咽癌的发生与发展机制,对改善鼻咽癌治疗效果、提高患者生存率有重大意义。血清和糖皮质激素诱导激酶1(SGK1)属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族,受血清和糖皮质激素转录刺激。胰岛素和生长因子通过PI3K、3-磷酸肌醇依赖激酶1(PDK1)或mTORC-2复合物诱导SGK1的表达。在哺乳动物中,SGK1在所有被检查的组织中都有表达,并调节着各种各样的细胞分子,包括细胞增殖转移和凋亡、离子通道等。但SGK1与鼻咽癌的相关性研究目前国内外尚未见报道。本文旨在研究SGK1在鼻咽癌组织中的表达情况,以及SGK1对鼻咽癌细胞生物学特性的影响,探讨SGK1表达与鼻咽癌发生发展的关系。方法:1.免疫组化法检测SGK1在21例鼻咽癌组织和13例慢性鼻咽炎症组织中的蛋白表达,卡方检验来比较SGK1在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中表达的差异。*** 2000瞬时转染鼻咽癌细胞,转染24小时在荧光显微镜下确认转染成功后,再培养24小时行Western blot检测转染后鼻咽癌细胞中SGK1的表达情况,选取SGK1沉默效果最显著的siRNA,构建沉默SGK1的鼻咽癌细胞。3.细胞生物学功能试验:CCK8法检测沉默SGK1后鼻咽癌细胞的增殖能力,流式细胞术检测其凋亡水平,Transwell迁移试验检测其迁移能力,存活率、凋亡率、Transwell迁移试验均采用单因素的方差分析进行组间比较。结果:1.免疫组化结果表明:SGK1的蛋白表达主要见于细胞质,在21例鼻咽癌组织中,SGK1蛋白的阳性表达率为76.19%,在13例慢性鼻咽炎组织中,SGK1蛋白的阳性表达率为15.38%,两组差异具有统计学意义(P<0.01)。2.成功构建了沉默SGK1的鼻咽癌细胞HNE-1/siSGK1,证实了SGK1表达下调可明显抑制鼻咽癌细胞的体外增殖、存活、迁移能力,并促进其凋亡水平。结论:***1在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织的表达有明显差异,鼻咽癌组织中呈高表达。2.沉默鼻咽癌细胞中SGK1的表达,明显抑制了鼻咽癌细胞增殖和迁移促进了凋亡。

关键词： 抗菌肽   磷酸化蛋白组学   MAPK1   过表达   敲除  

摘要： 目的1.研究观察抗菌肽merecidin作用于肺癌A549细胞后其细胞内所有蛋白质的磷酸化水平变化来确定抗菌肽对于肺癌A549细胞生物学功能的影响以及可能涉及到的信号通路及作用靶点。2.研究MAPK1过表达和敲除后,肺癌A549细胞的增殖,迁移、侵袭能力的变化以及抗菌肽作用于过表达、敲除MAPK1细胞株后其细胞增殖,迁移、侵袭能力的变化及相关分子机制。方法1.将肺癌A549细胞分为实验组和对照组,实验组肺癌A549细胞用9μmol/l的抗菌肽merecidin进行处理,6h后收集细胞并提取全蛋白进行BCA法定量,利用SDS-PAGE进行质量评估,随后全蛋白溶液加入胰酶进行酶解并获得所有蛋白质肽段,并对肽段依次进行TMT标记和HPLC分级,利用IMAC-Fe富集磷酸化肽段,最终采用高分辨质谱对富集肽段进行检测。利用Max Quant软件对质谱得到的磷酸化肽段进行搜库鉴定和定量,结合生物信息学分析差异磷酸化蛋白质的功能、通路等信息。2.利用RT-PCR(逆转录PCR)合成MAPK1目的基因CDS区,将其与过表达载体p CDH-CMV-MCS-EF1α-Green Puro经限制性内切酶Xba I和Not I酶切,将酶切片段与线性化载体连接,转化感受态细胞,合成过表达重组载体PCDH-MAPK1并进行测序验证。采用脂质体转染法分别将过表达重组MAPK1组(OE-MAPK1)和空载体对照组(OE-MAPK1-NC)转染至293T细胞进行病毒包装并进一步转染至肺癌细胞A549,并利用嘌呤霉素筛选稳定过表达的A549细胞。采用实时定量PCR技术(Real-time PCR)和蛋白质免疫印迹(Western-blot)实验检测过表达后MAPK1 m RNA和蛋白表达水平。3.设计并合成sg RNA靶点序列,将其连接至敲除载体后合成重组载体MAPK1-U6-sg RNA-EF1a-Cas9-P2A-puro并转化至感受态细胞,经测序筛选后,用脂质体转染法分别将敲除重组MAPK1组(KO-MAPK1)和空载体对照组(KO-MAPK1-NC)转染至293T细胞进行病毒包装并进一步转染至肺癌细胞A549,利用嘌呤霉素筛选稳定敲除MAPK1的A549细胞。采用Real-time PCR和Western-blot实验检测稳定敲除后MAPK1 m RNA和蛋白表达水平。4.采用CCK-8法检测空白组(Control)、过表达MAPK1组(OE-MAPK1)、过表达MAPK1空载体组(OE-MAPK1-NC)、MAPK1敲除组(KO-MAPK1)、MAPK1敲除空载体对照组(KO-MAPK1-NC)五组肺癌A549细胞的增殖能力的变化情况,以及抗菌肽merec-idin作用于Control、OE-MAPK1、KO-MAPK1后,其药物抑制率的变化情况。5.采用细胞划痕实验检测空白组(Control)、过表达MAPK1组(OE-MAPK1)、过表达MAPK1空载体组(OE-MAPK1-NC)、MAPK1敲除组(KO-MAPK1)、MAPK1敲除空载体对照组(KO-MAPK1-NC)五组肺癌A549细胞的迁移能力变化情况,以及抗菌肽merecidin作用于Control、OE-MAPK1、KO-MAPK1后,其迁移能力变化情况。6.采用Transwell试验检测空白组(Control)、过表达MAPK1组(OE-MAPK1)、过表达MAPK1空载体组(OE-MAPK1-NC)、MAPK1敲除组(KO-MAPK1)、MAPK1敲除空载体对照组(KO-MAPK1-NC)五组肺癌A549细胞的侵袭能力变化情况,以及抗菌肽merecidin作用于Control、OE-MAPK1、KO-MAPK1后,其侵袭能力变化情况。7.利用蛋白质免疫印迹(Western-blot)实验检测空白组(Control)、过表达MAPK1组(OE-MAPK1)、MAPK1敲除组(KO-MAPK1)以及经抗菌肽merecidin作用后在MAPK/ERK信号通路中MAPK1上下游蛋白变化情况。结果1.磷酸化蛋白组学最终检测出经抗菌肽merecidin处理后,差异磷酸化蛋白共有753个,其中RB1、MAPK1、ARAF、PTK2、FOXO、MARCKS等多个蛋白其磷酸化位点发生改变。2.利用慢病毒包装系统在人肺癌A549细胞中成功构建MAPK1过表达稳定转染株。3.利用CRISPR/CAS9系统在人肺腺癌细胞A549中成功构建永久敲除的MAPK1敲除细胞系。***-8法结果表明随时间增加,与空白组(Control)、过表达MAPK1空载体组(OE-MAPK1-NC)相比、过表达MAPK1组(OE-MAPK1)细胞吸光度(OD)值明显增加,而与空白组(Control)、敲除MAPK1空载体组(

关键词： 微小RNA   胰腺癌   血管生成因子  

摘要： 第一部分miRNA3178对胰腺癌细胞生物学功能的影响目的:研究miRNA3178在胰腺癌细胞和正常胰腺细胞中的表达情况,探讨miRNA3178在体外对胰腺癌细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响。研究方法:1.采用实时定量PCR方法测定胰腺癌细胞和正常胰腺细胞中miRNA3178的表达情况。2.采用CCK-8法化验检测转染细胞增殖情况,流式细胞术检测转染细胞凋亡及细胞周期分布情况,Transwell法检测细胞迁移能力。结果:1.与正常细胞系HPDE6C7相比,miRNA3178在AsPC-1细胞系中表达明显升高,而在PANC1细胞系中的表达则轻微下降。***3178类似物转染胰腺癌AsPC-1细胞后,显著抑制细胞的增殖和迁移能力,产生G0/G1期阻滞,诱导细胞凋亡。***3178抑制物转染胰腺癌AsPC-1细胞后,显著增加细胞的增殖和迁移能力,抑制细胞发生凋亡,加速细胞周期。第二部分miRNA3178对血管生成因子VEGF、bFGF和内皮抑素的影响。目的:研究miRNA3178表达与血管生成因子VEGF、bFGF和内皮抑素的关系研究方法:利用q RT-PCR和Western blot法检测miR-3178表达与肿瘤新生血管内皮因子的关系。结果:***3178过表达抑制了AsPC-1细胞中VEGF和bFGF的表达,并增强了内皮抑素的表达。***3178低表达促进了AsPC-1细胞VEGF和bFGF的表达,并抑制内皮抑素表达。结论:***3178在胰腺癌细胞系AsPC-1中的表达明显高于正常胰腺细胞。2.细胞功能方面,miRNA3178抑制胰腺癌AsPC-1细胞增殖和迁移能力,并诱导细胞凋亡。***3178可抑制胰腺癌AsPC-1细胞中血管生成因子VEGF和bFGF的表达水平,并促进内皮抑素表达,抑制肿瘤新生血管内皮生长。综上所述,miRNA3178可能是胰腺癌治疗的潜在靶点。

关键词： F.nucleatum   牙龈成纤维细胞   牙龈间充质干细胞   炎症反应   成骨分化   转录组测序   药物重定位   牙周炎   肿瘤相关基因  

摘要： 背景与目的:慢性牙周炎是一种在成年人中广泛流行的口腔感染性疾病。牙周炎发生时,大量的革兰阴性菌聚集于牙齿周围,导致牙龈组织炎症,牙周袋形成,大量细菌可以穿透上皮屏障进入深层结缔组织,进而导致牙槽骨丧失、牙齿松动脱落。具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,***)是一种重要的牙周致病菌,其在慢性牙周炎发生发展过程中的作用尚未引起重视。研究表明,F nucleatum是一种特殊的拥有多种凝集素的厌氧菌,可以粘附于多种宿主细胞表面,如上皮细胞、成纤维细胞、多形核白细胞等。然而,***是否可以粘附于牙龈源性细胞并发挥作用尚不是很清楚。牙龈成纤维细胞(gingival fibroblasts,GFs)是构成牙龈结缔组织的主要细胞,在维持牙周组织稳定性及调控宿主炎症免疫反应过程中发挥重要作用。同时,牙龈组织中亦包含有少量的牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stem cells,GMSCs),在牙周组织修复过程中发挥至关重要的作用。然而***是否可以粘附并侵入GFs及GMSCs,并引起细胞生物学性状的改变,及其背后的生物学意义及分子学机制尚不是很清楚。目前,关于有效治疗***引起的感染性疾病药物的研发尚不是很充分。因此,本课题旨在研究不同浓度的***感染牙龈源性细胞不同时间后,GFs及GMSCs的生物学活性,如细胞增殖、迁移、分化、炎性因子及活性氧(reactive oxygen species,ROS)等的产生是否会发生变化,并对GFs及GMSCs在***作用后细胞内生物学性状发生改变的详细作用机制进行深入探讨;旨在通过对时序性***与GFs共培养后全部转录组基因表达变化进行深入挖掘,寻找能够抵抗***保护GFs的药物,为临床治疗炎症感染性疾病提供新的思路;旨在通过对时序性F nucleatum与GMSCs共培养后细胞内全部转录组基因表达变化进行分析,对***降低GMSCs成骨分化能力的分子机制进行了深入探讨,进而为指导炎症微环境中牙周组织再生策略的实施提供一定的思路。材料与方法:***与牙龈源性细胞的培养鉴定及共培养模型的构建***标准株ATCC 25586源于山东省口腔组织再生重点实验室,将保存菌种解冻后,于固体培养基中进行培养获得单菌落。挑取单菌落接种于液体培养基进行扩大培养。利用特异引物进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)实验以及16s rDNA测序法鉴定Fnucleatum的纯度。牙龈标本取自临床进行第三磨牙拔除术中获得的牙龈组织,将获得的牙龈组织一分为二,一份通过苏木素-伊红染色进行炎症状态检测,另一份则进行细胞分离培养。利用酶消化法获得大量GFs,并通过有限稀释法分离培养获得人GMSCs。利用结晶紫染色实验鉴定GMSCs克隆形成能力。利用流式细胞仪对GMSCs表面标志物CD29、CD44、CD45、CD73表达进行检测。搜集对数生长期的***,建立*** 与 GFs(F nucleatum:GFs=10、50、100、200、400)及 GMSCs(***:GMSCs=10、50、100)共培养的细胞模型,并利用台盼蓝染色及结晶紫染色实验对共培养后细胞形态进行鉴定。***对GFs生物学活性的影响及机制研究首先创建感染复数(multiplicity of infection,MOI)为100的***与GFs共培养2h、6h、12h、24h、48h的细胞模型,各时间点均设置未与***共培养的正常生长GFs作为对照。利用高通量转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)技术对培养过程中细胞内全部转录组基因表达变化进行分析。寻找细菌感染细胞不同时间点后,细胞内持续发生变化的差异基因,并通过基因本体论(gene ontology,GO)与基因和基因组的京都百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)对筛选出的差异基因进行通路富集分析,明确与细胞增殖、凋亡、ROS及炎性因子产生相关的基因。构建***与GFs(MOI=10、50、100、200、400)共培养不同时间点的细胞模型。利用细胞计数实验及乙炔基脱氧尿苷(5'-ethynyl-2'-deoxyuridine,EDU)标签实验检测***对GFs增殖的影响。利用流式细胞仪分析方法对细菌感染后,细胞凋亡情况及ROS的产生