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关键词： 脱细胞羊膜   牙周膜干细胞   生物学功能   成骨  

摘要： 目的:体外实验探索人脱细胞羊膜对牙周膜干细胞生物学功能及成骨分化能力的影响方法:本实验采用组织块改良培养法分离和培养牙周膜干细胞,通过流式细胞术鉴定牙周膜干细胞,机械/酶消化法制备脱细胞羊膜基质,HE染色、免疫组化鉴定脱细胞情况和主要组分;倒置显微镜观察以及扫描电镜观察脱细胞羊膜表面结构,评价脱细胞羊膜基质作为细胞传递载体的潜力。利用脱细胞羊膜基质负载牙周膜干细胞,将其分为脱细胞羊膜基质组和TCP组（细胞培养板组）通过,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡率检测、CCK8、细胞粘附、Transwell迁移实验检测脱细胞羊膜对牙周膜干细胞生物学功能的影响,通过设置TCP（-）（细胞培养板未诱导组）、TCP（O）（细胞培养板诱导液组）、HAAM（-）（脱细胞羊膜未诱导组）、HAAM（O）（脱细胞羊膜诱导液组）,采用7、14、21天ALP染色、21天茜素红染色以及对7、14天ALP活性及21天茜素红染色半定量,利用RT-PCR、WB检测7、14、21天成骨相关蛋白COL1A1、ALP、OPN,以观察不同组别的成骨分化情况。结果:牙周膜干细胞分离和提取及脱细胞羊膜基质的制备成功。经检测脱细胞羊膜基质的主要胶原结构为I、Ⅲ型胶原,牙周膜干细胞能够正常在脱细胞羊膜上正常生长,细胞排列具有导向性,而且受到脱细胞羊膜纤维结构的影响;脱细胞羊膜负载的牙周膜干细胞与细胞培养板培养的牙周膜干细胞的细胞凋亡率、细胞凋亡周期比较,差异无统计学意义（p＞0.05）,并且脱细胞羊膜相比细胞培养板能够促进牙周膜干细胞的增殖、粘附和迁移;脱细胞羊膜负载的牙周膜干细胞在7、14、21天的ALP染色、茜素红染色、ALP与茜素红定量、RT-PCR、WB结果相互印证。结果显示,脱细胞羊膜能促进牙周膜干细胞的早期成骨分化,并且在中后期脱细胞羊膜诱导液组始终保持最大的成骨分化能力,而单纯的脱细胞羊膜对比细胞培养板,其成骨分化能力也得到加强。结论:推测脱细胞羊膜基质能够作为一种合适的细胞传递载体,模拟天然细胞外基质对牙周膜干细胞的增殖、粘附、迁移产生积极的影响并促进牙周膜干细胞的成骨分化能力。

关键词： 细胞生物学   电磁辐射   EB病毒   lmp1   p53蛋白  

摘要： 由手机造成的电磁辐射已成为一种无处不在的污染源，很有可能威胁健康。手机辐射的大小由比吸收率(Specific Absorption Rate，SAR)表示，即SAR值越大，手机辐射越高。SAR为2W/kg是手机辐射的行业标准，在特殊情况下(如电梯内使用手机时)，SAR值会更高，可达3-4W/kg。通讯环境状况良好时，手机SAR约为1W/kg，是弱电磁辐射。人类生活于物理和生物等多因素混杂的环境中，肿瘤也往往是多因素联合长期作用的结果。EB病毒是人类疱疹病毒，EB病毒在人群中的感染率超过90％，常为潜伏感染。Lmp1蛋白是表达在经过EB病毒感染过的细胞膜上的一种潜伏膜蛋白，lmp1基因是主要致癌基因，编码的蛋白具有诱导细胞转化的能力。因此将lmp1基因转染入细胞内，与电磁辐射联合作用能够加速细胞发生转化的速度。此外，将lmp1基因转染入细胞内并与电磁辐射联合作用，更加接近细胞的真实生活环境。　　本论文的研究目的就是研究电磁辐射短期以及电磁辐射与病毒癌基因长期联合作用对细胞增殖转化的影响。主要工作包括以下部分:　　一、探究1800MHz电磁辐射短期暴露对小鼠胚胎成纤维细胞系NIH/3T3细胞损伤。本研究采用1800MHz，SAR为2W/kg，以5min开/10min关的间断模式，分别辐照12、24、36、48h，暴露完毕，CCK-8检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞凋亡;real-timePCR、westernblot及免疫荧光检测损伤标志性分子p53表达情况;电镜检测线粒体结构。结果显示，经过12、36、48h电磁场暴露的细胞活性较相应的假暴露组细胞显著降低(P＜0.05)，流式细胞仪结果显示48h晚期凋亡率明显增加;辐照48h暴露组细胞p53mRNA是假暴露组细胞的1.4倍;免疫荧光结果显示，p53蛋白表达量在辐照24h和48h后暴露组较假暴露组相比有明显增加;电镜检测发现，经48h暴露后的细胞线粒体肿胀，出现囊泡及空泡状结构等线粒体损伤现象。0-36h暴露对细胞凋亡未见显著影响，1800MHz，SAR2W/kg电磁辐射48h后可以引起NIH/3T3细胞凋亡，凋亡的发生可能主要由于电磁辐射造成了线粒体损伤和p53表达上调。　　二、研究1800MHz电磁辐射长期暴露对NIH/3T3细胞增殖转化的影响。本研究构建了pcDNA3.1(+)-lmp1真核表达质粒，筛选出一株NIH/3T3-1mp1稳定转染细胞系。随后采用1800MHz，SAR为1W/kg电磁辐射，以5min开/10min关的间断模式，连续辐照90天，每天5h，每隔3-4天细胞传代，并将剩余细胞冻存。采用real-timeqPCR检测p53基因动态变化，westernblot检测p53蛋白表达，平板克隆检测细胞增殖。结果显示，辐照后p53基因呈波动性变化，病毒癌基因lmp1联合电磁辐射第40天时p53mRNA表达最高，在第60天单独电磁辐射及其与lmp1联合组p53基因表达同样很高。而westernblot结果无显著性差异。平板克隆结果显示，第40、60天时病毒癌基因联合辐照组以及第60天单独辐照组相对于其对照组，细胞形成克隆灶低，细胞增殖能力下降。所以，我们认为，电磁辐射与病毒癌基因lmp1联合作用细胞后，会使p53mRNA表达升高，诱导细胞增殖停滞，细胞克隆形成率降低，其分子机制有待后续研究。　　综上所述，本研究结果为进一步预防医学研究和卫生政策修订提供参考。

关键词： 急性髓系白血病   信号通路   神经纤毛蛋白-1   信号素3A   信号素4A  

摘要： 【目的】　　分析NRP-1、SEMA4A和SEMA3A表达变化对THP-1、U937生物学特性的影响，并分析该影响是否与MAPK/ERK、PI3K/AKT信号通路变化相关，初步探讨NRP-1、SEMA4A和SEMA3A在急性髓系白血病细胞中的作用及机制，为急性髓系白血病靶向治疗提供新靶点。　　【方法】　　1.提供目的基因信息，由上海吉凯基因科技有限公司协助构建NRP-1基因沉默、SEMA4A基因沉默和SEMA3A基因过表达的慢病毒载体，并完成病毒滴度测定。　　2.分别构建NRP-1沉默、SEMA4A沉默和SEMA3A过表达的THP-1、U937多克隆稳转株。通过CCK-8法检测细胞株增殖能力;通过AnnexinV及7-AAD标记的流式细胞术检测细胞凋亡水平;通过流式细胞术检测细胞株CD14、CD11b分化抗原的表达水平;通过PI标记流式细胞术检测细胞株细胞周期变化。　　3.通过Westernblot检测生物学特性发生改变的稳转株MAPK/ERK和PI3K/AKT信号中ERK、p-ERK、AKT和p-AKT的表达变化情况。　　【结果】　　***-1沉默、SEMA4A沉默和SEMA3A过表达的THP-1、U937多克隆稳转株分别构建成功，各组细胞株GFP阳性率均大于90%。U937细胞NRP-1、SEMA4A的mRNA表达下调率均>80%;THP-1细胞NRP-1、SEMA4A的mRNA表达下调率均>60%，THP-1、U937细胞的SEMA3A过表达效果均理想，分别为58.19倍、24.44倍。　　***-1沉默的THP-1和U937细胞增殖受限，凋亡增多。THP-1细胞分化抗原CD11b表达较阴性对照组下降(P＜0.05)，但下降幅度小;CD14表达与阴性对照比较无统计学差异(P＞0.05)。U937细胞CD11b表达上调(P＜0.05)。THP-1细胞的p-AKT表达下调，p-ERK表达上调;U937细胞表现为p-ERK表达下调。　　***4A沉默的THP-1细胞增殖受限，凋亡增多，分化抗原CD11b表达上调(P＜0.05),CD14表达上调(P＜0.01)，p-ERK表达下调。但SEMA4A沉默的U937细胞增殖、凋亡均无明显变化，CD11b表达上调(P＜0.05)。　　***3A过表达的THP-1、U937细胞增殖、凋亡均无明显改变。　　***-1沉默、SEMA4A沉默和SEMA3A过表达均不影响THP-1和U937细胞周期。　　【结论】　　***-1基因干扰慢病毒载体可沉默THP-1、U937细胞上NRP-1表达，明显抑制THP-1和U937细胞增殖并促进其凋亡，其机制可能与通过调节MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路影响THP-1和U937细胞增殖和凋亡相关。　　***4A基因干扰慢病毒载体可沉默THP-1细胞上SEMA4A表达，起到抑制THP-1细胞增殖，并促进其分化和促凋亡的作用，作用机制可能与MAPK/ERK信号通路相关。SEMA4A可能通过调控MAPK/ERK信号通路影响白血病细胞增殖、分化和凋亡，参与急性髓系白血病的发生与发展。

关键词： 缺氧   HIF-1α   甲基化   急性髓系白血病   5-hmC  

摘要： 目的:由于肿瘤细胞增殖过快普遍存在缺氧,而缺氧诱导的表观遗传改变可能是肿瘤细胞适应缺氧微环境的关键,是目前研究白血病重要发病机制之一。通过建立体外缺氧模型,研究缺氧对急性髓系白血病KG-1细胞增殖代谢影响、HIF-1α表达变化以及对基因组甲基化的影响,将肿瘤细胞缺氧代谢与表观遗传学联系起来,为急性白血病等血液系统恶性肿瘤的诊治研究提供了新的思路与实验依据。方法:1.以不同氧浓度(21%、3%、1%)处理急性髓系白血病细胞系KG-1细胞24、48、72小时,以常氧为对照组。用CCK-8法检测细胞活性,LDH试剂盒测定细胞培养基中LDH,以了解缺氧对KG-1细胞增殖代谢的影响。2.采用荧光实时定量PCR方法来检测HIF-1αmRNA表达,Western blot方法检测HIF-1α蛋白表达以了解缺氧对KG-1细胞中HIF-1α表达的影响。3.采用5-羟甲基化胞嘧啶(5-hmC)及5-甲基化胞嘧啶(5-mC)检测试剂盒检测5-hmC及5-mC含量,以了解缺氧及HIF-1α对KG-1细胞基因甲基化的影响。4.通过慢病毒感染HIF-1α真核表达质粒,使细胞过表达HIF-1α。实验分为慢病毒载体GV358+常氧对照组、过表达GV358-HIF-1α+常氧组、慢病毒载体GV358+缺氧组、过表达GV358-HIF-1α+缺氧组共四组。采用荧光实时定量PCR、Western-blot方法检测HIF-1αmRNA及蛋白的表达水平。采用抗原抗体免疫检测细胞基因组DNA的甲基化态势(5-hmC及5-mC含量)、甲基化特异性PCR(MSP)检测细胞中P15基因启动子区甲基化。以了解HIF-1α过表达对KG-1细胞基因组甲基化及P15基因甲基化的影响。5.采用YC-1抑制HIF-1α的表达。实验分为DMSO+常氧对照组、YC-1+常氧组、DMSO+缺氧组、YC-1+缺氧组共四组。采用荧光实时定量PCR、Western-blot方法检测HIF-1αmRNA及蛋白表达水平。采用抗原抗体免疫检测细胞基因组DNA的甲基化态势(5-hmC及5-mC含量)、MSP检测细胞中P15基因启动子区甲基化,以了解HIF-1α抑制对KG-1细胞基因组甲基化及P15基因甲基化的影响。结果:1.缺氧促进了KG-1细胞增殖及代谢,且随着缺氧程度增加及时间的延长,其增殖活性及代谢逐渐增强(P<0.05)。2.缺氧促进KG-1细胞中HIF-1αmRNA及蛋白的表达,其中1%O48h组表达最高(P<0.05)。3.缺氧组KG-1细胞5-hm C含量均高于常氧组,而5-mC含量均低于常氧组(P<0.05)。***-1α过表达后结果显示:与正常对照组相比,HIF-1α过表达组HIF-1αmRNA及蛋白表达水平增强、5-hmC含量增加,5-mC含量减少(P<0.05);HIF-1α过表达+缺氧组细胞HIF-1α表达水平、5-hmC含量较正常对照组明显增强(P<0.05);与正常细胞缺氧组相比,HIF-1α过表达+缺氧组KG-1细胞HIF-1αmRNA及蛋白表达、5-hmC含量亦增高,5-mC含量亦减少(P<0.05)。常氧情况下,KG-1细胞表现出P15基因启动子区部分甲基化,缺氧处理或/和HIF-1α过表达后P15基因启动子区呈现去甲基化。***-1α抑制后结果显示:与DMSO+常氧对照组相比,YC-1组KG-1细胞HIF-1αmRNA及蛋白表达水平减少,5-hmC含量减少,而5-mC含量增多(P<0.05);与正常细胞缺氧组相比,YC-1+缺氧组KG-1细胞HIF-1αmRNA及蛋白表达减少,5-hmC含量减少,5-mC含量增多(P<0.05);YC-1抑制HIF-1α表达后,P15基因启动子区甲基化增强。结论:1.缺氧可促进KG-1细胞的增殖、代谢,缺氧越严重及缺氧时间越长,KG-1细胞增殖活性及代谢越强。2.缺氧促进KG-1细胞中HIF-1αmRNA及蛋白的表达。3.缺氧或HIF-1α过表达可促进KG-1细胞基因组及P15基因去甲基化,HIF-1α表达抑制可使KG-1细胞基因组及P15基因甲基化增强。

关键词： Mg-1Mn合金   降解性能   细胞毒性   成骨性能  

摘要： 目的:1、研究Mg-1Mn镁合金颌面骨修复材料生物体外腐蚀降解行为,探讨其耐腐蚀降解机制。2、研究Mg-1Mn镁合金颌面骨修复材料对骨髓间充质干细胞的细胞毒性和成骨分化能力。方法:1、采用浸泡腐蚀研究方法,检测Mg-1Mn镁合金颌面骨修复材料体外腐蚀降解性能。将Mg-1Mn镁合金颌面骨修复材料分别浸泡于模拟体液(SBF溶液)1、3、5、10和20天,使用分析天平检测材料腐蚀浸泡前后质量变化规律,使用扫描电子显微镜(SEM)观察材料腐蚀浸泡后表面形貌特征,并使用能谱仪检测腐蚀产物元素组成。2、间接法检测大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)活性。根据GB/T 16886.5-2017标准,制备Mg-1Mn镁合金颌面骨修复材料浸提液,使用DMEM-F12培养基,配置4组浸提液浓度(100%、75%、50%、25%)的细胞培养液,使用CCK-8试剂盒检测不同浸提液浓度下BMSCs活性。3、成骨相关基因Col I m RNA检测。基于前期细胞活性实验研究结果,选择浓度25%Mg-1Mn镁合金颌面骨修复材料浸提液的培养基添加成骨诱导液后培养BMSCs 7天,使用实时定量PCR技术检测目标基因Col I m RNA的表达情况。培养BMSCs 21天,茜素红染色观察矿化结节的沉积。结果:1、Mg-1Mn镁合金颌面骨修复材料经SBF溶液浸泡后,第1天至第5天降解速率呈明显的下降趋势,5-10天呈现一个稳定的降解速率,至20天降解时间结束,降解速率极小。平均腐蚀降解速率为0.0042 mm/年。2、SEM结果显示:Mg-1Mn合金表面发生了明显的点蚀,刚开始为小的凹坑,随着时间的增长,基体表面的腐蚀凹坑相连逐渐变大形成深坑,第10天、20天时,均观察到腐蚀严重的合金表面,未发现腐蚀形貌有随着时间的增加而发生明显变化的现象。表明浸泡至20天时逐渐形成的薄膜保护镁合金基体防止其进一步腐蚀。3、流式细胞术结果显示:分离培养的第三代细胞表达CD29(99.93%),CD90(99.97%)呈阳性;CD45(1.31%)呈阴性,与所报道BMSCs表型相符。4、CCK-8法检测结果显示:细胞与4组浸提液(100%、75%、50%、25%浓度)共培养1、3天时,25%Mg-1Mn合金浸提液的细胞毒性为1级,符合生物医用材料的标准规定。从第5天起,细胞毒性均高于1级,但25%Mg-1Mn合金浸提液对细胞的增殖的抑制影响一直保持最小。5、q RT-PCR结果显示:25%Mg-1Mn合金浸提液组细胞的Col I的m RNA相对表达呈明显上调趋势。6、茜素红染色结果显示:25%Mg-1Mn合金浸提液组矿化结节染色面积更大。结论:(1)Mg-1Mn合金具备较为优异的耐腐蚀降解性能。(2)Mg-1Mn合金在SBF溶液中发生了明显的点蚀,前10天,随着时间的增长,基体表面的腐蚀凹坑深度不断增加。在10-20天时,Mg-1Mn合金处于一个缓慢稳定的腐蚀降解状态。(3)25%Mg-1Mn合金浸提液对BMSCs的细胞活性的抑制影响最小。(4)25%Mg-1Mn合金浸提液对BMSCs的成骨能力有促进作用。

关键词： 纳米酶   催化活性   细胞杀伤能力   细胞凋亡  

摘要： 纳米酶(Nanozyme)是一类本身蕴含酶学特性的纳米材料，属于新型人工模拟酶，具有稳定性高，成本低，可控且规模制备等独特的优势，可作为天然酶的替代物，应用于生物医学和生物体内的催化反应。除了类似酶的催化活性，纳米酶还兼具纳米材料独特的物理化学特性，比如光热特性、荧光特性、超顺磁性等，使得纳米酶被设计成多功能分子用于疾病的检测、诊断和治疗，逐渐形成了纳米酶学研究新领域。　　自2007年，实验室首次报道Fe3O4纳米颗粒具有类过氧化物酶活性以来，迄今已有来自全球30多个国家的300个研究单位发表了超过2000篇文章，报道了500多种纳米酶。其中，有近3/4是研究纳米酶的应用，涵盖了环境治理、生化检测以及疾病的诊断和治疗，纳米酶的应用正在从体外检测向体内治疗延伸。在纳米酶催化治疗方面，主要是通过调控体内活性氧自由基(ROS)水平，观察到改善神经退行性疾病、缓解炎症、抑制肿瘤生长等现象。然而，对于纳米酶在体内的生物学行为和分子机制还缺乏规律性和普遍性的认识，这也是纳米医学所面临的主要挑战。　　本文旨在探究纳米酶进入到细胞后的生物学效应以及分子机制。为了研究纳米酶细胞生物学的普遍规律，选择了一类蕴含过氧化物酶活性的纳米酶作为研究对象。这是一类研究最多、应用最广泛、在目前报道的500多种纳米酶中占60％以上。将物理化学性质相似但是过氧化物酶活性高低不同的纳米酶与多种细胞系共同孵育，借助生化分析与组学测序技术，观察细胞对过氧化物纳米酶的响应状态，揭示纳米酶细胞生物学效应的主要表现，提出纳米酶影响细胞活性的分子机制。　　首先，为了统一纳米酶的物理化学性质对细胞活性的影响，设计合成以球形为主、尺寸相近，表面电负性的纳米酶，包括V2O5、Cu(OH)2、Ag、ZnO、TiO2、Fe2O3、SiO2以及4种不同尺寸的Fe3O4。然而这些纳米酶有一个共同的特征，即蕴含过氧化物酶的催化功能，曾被报道能通过调控ROS来体内杀菌、抗生物膜以及肿瘤治疗。采用单位质量的酶活性单位即U/mg的标准化方法来定量纳米酶的催化活性。这11种纳米酶都表现出过氧化物酶活性，它们的酶活性从0.03U/mg、5.10U/mg到28.80U/mg，涵盖了惰性、低反应活性到高反应活性。　　然后，通过细胞增殖/毒性检测实验观察纳米酶对细胞活性的影响。为了揭示纳米酶对细胞影响的普遍性，选用包括肿瘤细胞、正常细胞在内的9株细胞系进行实验。实验结果表明，11种过氧化物纳米酶对检测细胞系具有一个普遍的杀伤效应。比较两种纳米酶量化指标，即过氧化物酶催化活性与细胞杀伤能力，二者成正相关关系，皮尔森相关系数为0.95(P＜0.001)。更有意义的是，发现纳米酶处理后细胞内累积大量的囊泡、线粒体肿胀变圆、内质网变性、各级溶酶体增多、染色质凝集和边缘化。而这些形态改变既不同于细胞皱缩变小、产生凋亡小体的细胞凋亡，细胞膜破裂、内容物释放的坏死和焦亡，也不同于出现双层膜自噬小体的自噬和线粒体皱缩变小的铁死亡。进一步，对Fe3O4纳米酶处理后的细胞进行组学测序以及生化检测，发现纳米酶介导的细胞死亡伴随着固醇类、脂类的过度合成，ACLY依赖的KRAS信号通路调控了纳米酶诱导的细胞死亡，而KRAS敲除细胞对这一死亡进程具有高度的抗性。动物水平的抗肿瘤实验表明瘤内注射的纳米酶抑制肿瘤生长;纳米酶与细胞提前孵育可以完全抑制肿瘤生长。　　综上，这项工作揭示了一类过氧化物纳米酶诱导细胞死亡的独特效应，无论是细胞形态，还是生化特征都不同于单纯的细胞凋亡、坏死、焦亡、自噬或铁死亡。为此，将其命名为“纳米酶死亡”(Nanoptosis)。同时，还鉴定出ACLY-KRAS参与纳米酶死亡的调控，以上结果不仅对过氧化物纳米酶诱导细胞死亡的普遍性有了初步的认识，同时也为纳米酶的体内应用研究提供了理论依据和参考价值。

关键词： 内皮祖细胞   内皮克隆形成细胞   旁分泌   细胞增殖   血管形成   创面愈合  

摘要： 研究背景和目的:2型糖尿病(T2D)是最常见的代谢性疾病之一,其主要特征是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗而出现慢性高血糖。慢性创伤具有特征性的病理联系,不能通过有序和及时的修复来恢复结构和功能的完整性。在糖尿病患者中,每年有2%-3%的患者发生足部溃疡。糖尿病足是一种严重的T2D并发症,常导致疼痛、痛苦和生活质量低下。内皮克隆形成细胞(Endothelial colony-forming cells,ECFCs)被认为晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),在创伤修复中的作用受到广泛关注。ECFCs是一种来源于骨髓的原始细胞,在一定的条件下可诱导分化成为成熟的内皮细胞(endothelial cells,ECs)。该细胞不仅参与胚胎时期的血管生成,而且在人体出生后的血管新生、血管损伤的内皮修复以及功能维持中仍然有重要的作用。干/祖细胞对创面的修复机制可概括为:(1)分化为成熟内皮细胞;(2)旁分泌产生多种生物活性的细胞因子促进创面的血管新生及神经再生。为此,我们推测内皮克隆形成细胞通过旁分泌机制可促进糖尿病患者慢性创面的愈合以及破损处血管再生。本实验通过探讨ECFCs条件培养基(Conditioned medium,CM)对人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)和人真皮成纤维细胞(Human Dermal Fibroblasts,HDFs)的作用功能,为ECFCs对于糖尿病患者创面修复作用提供新思路和理论支持。方法:***的提取、分离培养及鉴定1.1 ECFCs细胞提取及分离培养:采集健康志愿者脐带血,采用密度梯度离心法获得单个核细胞,将人纤维蛋白加入六孔细胞培养板中,置于37℃培养箱中孵育3h进行包被,接种到包被人纤维蛋白的细胞培养板中进行培养;1.2 ECFCs细胞鉴定:将培养的ECFCs细胞,采用流式细胞仪及免疫荧光法检测ECFCs细胞表面抗原,Matrigel成管实验对ECFCs细胞进行体外检测,共聚焦法检测ECFCs细胞对于Dil-acLDL和FITC-UEA-I的摄取结合能力。***-CM制备与细胞因子检测2.1细胞条件培养基ECFCs-CM的制备:对数生长期的ECFCs细胞于无血清的M199基础培养液中置于常氧和低氧条件下持续培养24h和48h,收集上清液,即为条件培养液(ECFCs-CM);2.2.细胞条件培养基(ECFCs-CM)细胞因子检测:采用抗体芯片及ELISA法检测ECFCs-CM细胞因子表达;***-CM对HUVECs和HDFs细胞的生物学作用3.1 CCK-8法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞增殖能力的影响;3.2细胞划痕法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs迁移能力的影响;3.3 Transwell间接共培养法检测ECFCs对HUVECs和HDFs迁移能力的影响;3.4流式细胞仪检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞周期的影响;3.5流式细胞仪检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞凋亡的影响;4.丝素蛋白/海藻酸钠水凝胶的制备结果:***细胞提取及培养:ECFCs原代培养第4天,见少量呈纺锤形贴壁细胞,呈集落样生长集落中间可见圆形细胞,周边为梭形细胞,其结构与形状和血岛极其相似,ECFCs原代培养第8天,细胞集落开始接触融合;ECFCs原代培养第14天,细胞呈典型的“铺路石”样生长;***细胞的鉴定:流式细胞仪检测显示KDR、CD144(vWF)高表达,CD34部分表达,CD133、CD45低表达;Matrigel基质胶上形成管腔样结构,表现出典型的内皮细胞特征;3.抗体芯片检测显示,细胞条件培养基ECFCs-CM在常氧和低氧条件下多种细胞因子高表达,随时间表达谱稍有不同。在低氧条件且持续培养48h更有利于细胞培养液上清中细胞因子表达;ELISA法检测显示,EBM-2组的细胞上清液中的PDGF-BB、IL-8和EGF无表达,ECFCs-CM组的细胞上清液中的PDGF-BB、IL-8和EGF表达量较高;***-CM对HUVECs和HDFs细胞的作用:CCK-8法检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞增殖情况明显高于EBM-2组(P<0.05);细胞划痕法检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞培养至0h、6h和12h和24h细胞迁移覆盖率明显大于EBM-2组(P<0.05);Transwell间接共培养法检测显示ECFCs-CM共培养组的HUVECs和HDFs细胞数明显高于EBM-2组(P<0.05);流式细胞仪检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs

关键词： 系统性红斑狼疮   脂肪间充质干细胞   迁移   自噬   衰老  

摘要： 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种慢性自身免疫性疾病,传统的治疗方案存在多种副作用,对患者的生活质量造成较大的影响。干细胞疗法是一种新兴的治疗方法,脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)是其中一种具有高增殖、可多向分化、免疫调节、免疫原性低等特点的多能干细胞。多项研究证实,ADSC能减轻和治疗多种自身免疫性疾病。有研究指出:SLE 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)存在基本属性缺陷,自体来源的BMSC移植治疗SLE的效果欠佳。而目前未见有关于SLE脂肪间充质干细胞生物学特性和功能特征的相关研究。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)参与细胞的蛋白质合成、增殖、生长、细胞代谢等多项生命活动,我们前期研究发现mTOR通路在狼疮鼠肾脏过度活化,参与狼疮发病,推测其可能与间充质干细胞的病态相关。目的本实验目的拟通过分离、体外培养系统性红斑狼疮小鼠模型(MRL/lpr)的脂肪间充质干细胞(ADSCs),观察其生物学特性包括细胞形态、增殖和迁移能力、细胞凋亡、衰老、自噬情况及AKT/mTOR信号通路的变化,与正常C57小鼠来源的ADSC相比较,分析其细胞生物学特性及相关机制,为脂肪间充质干细胞的临床应用提供实验依据。方法1、采用Ⅰ型胶原酶消化原代分离正常C57小鼠和MRL/lpr狼疮小鼠脂肪间充质干细胞,并体外传代培养至第3代,进行后续实验。2、普通光学显微镜下观察小鼠ADSC形态;CCK-8检测细胞生长曲线。3、细胞划痕实验与Transwell实验检测各组ADSC的迁移能力;Annexin V FITC-PI双染法流式检测细胞凋亡情况;β-半乳糖苷酶染色法用于细胞衰老的检测;4、Western blot 检测第 3 代 ADSC LC-3、Beclin-1、P62、P21、P53、mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt蛋白的表达情况。5、应用SPSS 22.0软件对数据进行分析,实验数据以均数±标准差(x±SD)表示。两样本间定量资料采用独立样本t检验或单因素方差分析。p<0.05表示差异有统计学意义。结果1、成功原代培养小鼠脂肪干细胞。细胞经培养6-7天后达到80%以上的融合,胰酶消化传代后的细胞增殖速率较原代增快,并可稳定增殖和传代,细胞形态为典型的长梭形,密集排列呈网状、漩涡状。两组低周龄小鼠ADSC形态基本相似,基本呈长梭形;高周龄(18-20周龄)MRL/lpr小鼠的ADSC大部分呈梭形,细胞体积增大,并可见较多折光性圆形、多角形细胞。2、细胞生长曲线显示:4-6周龄C57小鼠和MRL/lpr小鼠的ADSC增殖能力较强,生长曲线大致呈“S”形,有典型的潜伏期、快速增殖期、平台期。而较大周龄的MRL/lpr小鼠ADSC增殖能力较弱,仅在最初第3-4天具有一定的增殖能力,高峰值较年轻小鼠低,随后增长速度逐渐降低。3、细胞划痕结果显示:划痕后24h,低周龄MRL/lpr小鼠ADSC的迁移率较同周龄C57 ADSCs的迁移率低(p<0.05)。与低周龄MRL/lpr小鼠ADSC相比,较高周龄MRL/lpr ADSC的迁移率更低(p<0.05)。Transwell实验结果与细胞划痕结果相一致。4、两组低周龄小鼠ADSC凋亡情况相似,未见明显差异。两组低周龄小鼠ADSC细胞衰老染色结果相近,而较大周龄狼疮鼠ADSC的衰老染色细胞增多。5、与同周龄C57小鼠ADSC相比,低周龄狼疮鼠组ADSC衰老相关蛋白P53表达较C57组高(p<0.05);狼疮鼠组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62表达较C57组高(p<0.05);而mTOR通路相关蛋白mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt表达与C57组无明显差异。结论与正常小鼠相比较,系统性红斑狼疮MRL/lpr小鼠ADSC存在异常:细胞迁移能力下降,自噬活动活跃,衰老相关蛋白P53表达增加,但mTOR通路表达无明显差异,提示系统性红斑狼疮ADSC部分细胞特性及功能的异常,存在早衰倾向,但与mTOR通路无明显相关。与低周龄MRL/lpr小鼠ADSC相比较,高周龄MRL/lpr小鼠ADSC细胞形态改变,增殖、迁移能力下降,衰老指标升高,提示随着动物周龄的增大,提取的脂肪干细胞的质量可能下降。

关键词： pH值   伊立替康   胃癌   细胞增殖   细胞凋亡  

摘要： 目的:胃癌是我国发病率第一的消化道恶性肿瘤,死亡率在所有恶性肿瘤中排第三,尽管近年来其发病率有所降低,但死亡率仍高居不下,是严重危害人们健康的最常见的一种恶性肿瘤。化学药物治疗是胃癌患者的主要治疗选择,其中伊立替康是可供选择的晚期胃癌一线化疗药物,但仍有很多患者因为化疗药物耐药性问题而导致治疗疗效降低。近年来,越来越多的研究指出恶性肿瘤微环境pH值在肿瘤发生、发展和耐药方面发挥着重要作用。且恶性肿瘤微环境最重要的两个标志为缺氧和呈酸性(低pH值),这种肿瘤特殊的微环境特性使一些弱碱性的化疗药物疗效受到影响。本研究旨在探讨不同pH值条件下伊立替康(CPT-11)对胃癌BGC823细胞的生物学特性(即增殖、凋亡和侵袭能力)的影响及其初步机制研究。方法:体外进行胃癌BGC823细胞株的常规培养,采用细胞活性检测试剂盒(CCK-8)法检测伊立替康(CPT-11)对不同pH值培养条件下的胃癌细胞BGC823增殖活性的影响;荧光显微镜观察凋亡细胞形态;胃癌细胞凋亡率用流式细胞术Annexin V-PI双染法检测;采用qRT-PCR法检测核因子-κB(NF-κB)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、凋亡相关基因(Bax)在胃癌细胞中的表达。结果:(1)当pH值为7.2时,即正常pH值下,伊立替康(CPT-11)浓度越高,胃癌BGC823细胞增殖受到的抑制作用也越大,伊立替康(CPT-11)对胃癌BGC823细胞的半数抑制浓度(IC50)值为73.8 μg/ml。(2)48 h 时,细胞的 OD 值(450nm),当 pH 为 6.8 时为 2.65±0.16,pH为7.2时为1.96±0.12,pH为7.6时为1.67±0.09,相比pH值为6.8时的细胞OD值(450nm),pH值为7.2和7.4时的OD值均显著减小(p<0.05);72h时,细胞 OD 值(450nm)在 pH6.8 组为 3.44±0.07,pH7.2 组为 2.69±0.07,pH 7.4组为1.75±0.23,pH7.6组为1.58±0.2,且相比pH6.8组,pH7.2、pH7.4和pH7.6组的细胞OD值(450nm)均明显降低(p<0.05);pH7.4组与pH7.6组两组比较无明显统计学差异(P>0.05)。(3)细胞培养48h后,在pH值为6.8、7.2组的胃癌细胞呈对数生长,细胞状态良好,形态规则。在弱碱性条件下(pH值为7.4、7.6组),细胞数目明显减少,形态不规则。胃癌BGC823细胞经伊立替康处理后发生凋亡的细胞数量随着pH浓度的升高而明显增多。(4)pH6.8组的细胞凋亡率为(8.5±0.98)%,pH7.4组的细胞凋亡率为(18.1±0.65)%,pH7.6 组为(18.8±0.49)%。与 pH6.8 相比,pH7.4 和 pH7.6时的细胞凋亡率均显著升高(p<0.05)。pH6.8组的划痕愈合率明显高于pH7.6组(p<0.05),与pH7.2组无明显统计学差异(P>0.05)。(5)在不同的pH值条件下,伊立替康(CPT-11)处理后,胃癌BGC823细胞Bcl-2、NF-κB、Bax基因的表达水平存在显著性差异(P<0.05),其中Bcl-2和NF-κB基因表达水平随着pH升高明显降低,Bax基因表达水平明显升高。结论:一定程度上提高肿瘤细胞外环境pH值,能提高伊立替康(CPT-11)对胃癌BGC823细胞增殖的抑制能力,并促进肿瘤细胞凋亡,即胃癌肿瘤细胞外的碱性环境能提高CPT-11对肿瘤细胞凋亡的作用,抑制肿瘤细胞增殖和侵袭的能力,而这种与胃癌肿瘤微环境pH值相关的伊立替康(CPT-11)抗肿瘤疗效的提高可能是通过抑制NF-κB、Bcl-2等抗凋亡基因及提高Bax促凋亡基因表达来实现的。

关键词： 低温储存   胞内冰   相界面移动   微丝骨架   细胞生物学   传热传质  

摘要： 生物材料在冷驱动下,材料细胞内将产生冰晶,细胞内冰晶的形成会导致严重的细胞损伤从而破坏生命材料的质量。细胞内冰晶的形状、尺寸、生长速率和方向都将对细胞以及细胞间隙产生影响。细胞层面的基础研究是必不可少的一部分。因此了解胞内冰的形成过程、形成原因以及对细胞损伤的程度是必要的,特别是细胞内相界面移动特征的观察研究,获取冷驱动下胞内冰生长的详细信息可为低温环境中生命材料保持良好状态提供重要的理论依据。为了便于量化研究,以体积大易观察的洋葱细胞作为研究对象,采用不同的降温速率、不同的接种冰晶方式,并利用低温显微系统配合高速摄像机,可视化研究细胞内清晰的相界面移动过程。同时,为了进一步了解不同生命材料的细胞内结构对胞内冰形成的影响,以蚕豆种子为研究对象,用细胞松弛素B溶解细胞骨架,采用低温显微系统在不同的冷却速率下进行冷冻实验。应用数字图像的相关方法记录胞内冰的生长过程,计算胞内冰晶出现的频率与细胞骨架变化的关系以及不同冷冻方法对胞内冰生长的影响。采用高速摄像仪观察冰晶生长过程,实验发现了三种模式的胞内冰晶生长行为。模式A:细胞壁结晶后继续在边缘结晶;模式B:细胞壁结晶后,向中心扩散,横贯中心位置;模式C:中心首先结晶,扩散至细胞边缘。并通过统计学方式,对三种不同过程的冰晶生长速率进行了计算分析。研究发现冷冻方式起着关键作用,接种冰晶影响细胞内冰晶的形成温度及冰晶的生长速率;冷却速率影响胞内冰的生长模式,在结晶温度相同时,模式A出现的概率最大。随着冷却速率增加,模式A出现的概率降低,模式B和模式C出现的概率增加。在相同模式下,冷却速率越大,冰晶的生长速率越快;相同冷却速率下,模式B生长速率最快。胞内冰的出现会导致生命材料的细胞出现损伤,实验结果发现,胞内冰的生长受到冷却速率的影响,增加冷却速率使得在相同温度下细胞内冰晶出现的概率降低。但冷却速率的增加也使得细胞的边缘冰晶生长速率增加,通过光强度图分析发现,此时出现的冰晶使得细胞的损伤程度增加。细胞内冰晶的形成与细胞骨架的结构有关,实验结果表明,使用细胞松弛素B处理过的细胞在冷冻过程中结晶时的温度更高,结晶所用的时间更短。但细胞内骨架的结构对胞内冰晶的生长模式影响较小。最后为全面了解植物材料在整个冷冻过程中的损伤程度,使用灰度检测的方式对细胞变形进行了测量与绘制,通过比较细胞冷冻前后的变形场,发现不同的冷冻参数的设定对细胞的损伤程度不同,随着冷却速率的增加,细胞内的变形程度减小,并且通过接种冰晶的方式可以减少细胞的变形。