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关键词： 口腔癌   外泌体   口腔黏膜成纤维细胞  

摘要： 背景:口腔癌是口腔黏膜发生的最常见的恶性肿瘤,其特点是浸润性广、进程快、预后较差,5年存活率只有50%5%。肿瘤的进展是由上皮和间质的相互作用,构成的肿瘤与宿主界面微环境决定的。癌相关成纤维细胞(CAFs)占肿瘤微生态环境的主要部分,它能够促使口腔癌的侵袭和转移,但其来源仍存在争论。有研究表明肿瘤细胞的调控使成纤维细胞被激活成为CAFs,但作用机制不明。近年来研究表明,肿瘤细胞可分泌外泌体,其中含有大量可促进其生长、侵袭和转移的蛋白质、RNA和脂质,细胞通过释放外泌体影响受体细胞的状态和功能。关于胰腺癌的相关研究,结果表明,胰腺癌细胞分泌的外泌体可以将癌细胞中的miR-155传递给成纤维细胞,诱导其活化为CAFs。但对于口腔癌细胞来源外泌体(Cal27-exo)在成纤维细胞活化中发挥的作用尚未见报道。目的:本研究通过将Cal27-exo与正常口腔黏膜成纤维细胞(NOMFs)共培养,检测NOMFs对Cal27-exo的摄取情况,并测定与Cal27-exo共培养后NOMFs(NOMFs+Cal27-exo)的增殖和迁移能力以及相关蛋白的表达。探讨Cal27-exo对NOMFs的诱导、活化,以及对NOMFs生物学行为的影响。初步探索NOMFs+Cal27-exo在口腔癌侵袭和转移中的调节作用。方法:1.采用组织块酶消化法原代培养NOMFs,并通过透射电镜和免疫荧光染色鉴定细胞来源;2.采用超速离心法提取Cal27-exo,并用蛋白免疫印迹、透射电镜以及粒径检测对外泌体进行鉴定;3.用PKH67标记Cal27-exo,并与NOMFs共培养,鉴定NOMFs对Cal27-exo的摄取情况;4.采用CCK8法检测NOMFs+Cal27-exo的增殖活性情况;5.采用划痕实验分析NOMFs+Cal27-exo迁移能力;***-PCR检测NOMFs+Cal27-exo相关蛋白的表达。结果:1.组织块酶消化法成功获得NOMFs,倒置显微镜观察:细胞呈扁平长梭形,大小均匀,单核,核椭圆形,位于胞质中央。排列有一定的方向,单层细胞生长,存在接触抑制。透射电镜显示:NOMFs核大且为椭圆形,无明显的凹陷,仅部分核膜为锯齿状,胞浆内细胞器较发达,富含粗面内质网、核糖体、高尔基体,可以见到散在微丝。免疫荧光染色鉴定:抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性。2.超速离心法成功提取Cal27-exo,蛋白免疫印迹示Cal27-exo高表达阳性标记蛋白Alix,CD63和TSG101。透射电镜下Cal27-exo呈直径在70-120mm之间的类圆形双层膜性囊泡。纳米粒径分析显示Cal27-exo粒径在30-150nm之间。***67将Cal27-exo标记为绿色Cal27-exo与NOMFs共培养后,成功进入NOMFs内。***8结果显示与NOMFs相比,分别共培养24h、48h、72h、96h后NOMFs+Cal27-exo的增殖活性明显增强(P<0.05),且呈时间依赖性。5.划痕实验结果示:与NOMFs相比,共培养后的NOMFs+Cal27-exo在划痕后12h的迁移能力无明显改变(P>0.05),但在18h、24h、36h、48h其迁移能力增强(P<0.05),直至划痕愈合。***-PCR结果显示:与NOMFs相比,NOMFs+Cal27-exo中PDGFR-α、VEGF和Tn-C三种蛋白的mRNA表达增加(P<0.05),α-SMA的mRNA表达减低(P<0.05),TGF-β的mRNA表达增加(P>0.05),FAP的mRNA表达减低(P>0.05),表明与Cal27-exo共培养后NOMFs被活化。结论:组织块法可成功培养出口腔黏膜成纤维细胞;Cal27能分泌丰富的外泌体,并且通过超速离心法有效分离;共培养后NOMFs+Cal27-exo的增殖活性和迁移能力明显增强,且相关蛋白的mRNA表达增加,Cal27-exo可以活化NOMFs,提示可能对于肿瘤的侵袭转移有潜在意义。

关键词： 人尿源干细胞   髓核细胞   外泌体   细胞外基质  

摘要： 背景:下腰痛(Low Back Pain)为现代社会中最常见疾患之一,对患者的生活造成了严重的影响。流行病学研究显示,超过80%的人在其一生中出现过一次或多次下腰痛的经历,超过15%的人疼痛程度需要住院治疗才能得到缓解。目前的病因学研究显示超过40%的下腰痛来源于椎间盘退变(Intervertebral Disc Degeneration,IDD)的继发病变。椎间盘退变是人体的一种自然衰老过程,但它可引起腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症、腰椎滑脱症等疾病。椎间盘退变是多层面、缓慢进展的过程,其中由于退变椎间盘中髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)数量减少和活性降低而导致细胞外基质合成减少是导致椎间盘退变的重要因素之一。因此,寻找减缓甚至逆转椎间盘退变的方法,一直是该领域的研究热点之一。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是具有自我更新及多项分化潜能的成体干细胞。近年来有研究证明,可通过干细胞移植抑制髓核细胞退变及凋亡,并有研究报道间充质干细胞可通过其分泌的外泌体(Exosome)调节NPCs中蛋白聚糖(ACAN)、Ⅱ型胶原(COL2)的表达以提高髓核细胞活性。然而干细胞获取手段多为有创,且来源有限,使其受到限制。人尿源干细胞(Urine-derived stem cells,USCs)是一种来源于尿液的干细胞,其来源广泛、取材简易、安全无创、不涉及伦理道德,是外泌体的理想来源。已有研究证明,人尿源干细胞来源性外泌体(USC-Exos)具有改善微环境、增强代谢、促进细胞再生及组织修复等能力。外泌体具有类似细胞膜的双层磷脂膜结构,并携带大量细胞来源的mRNA、mi RNA、蛋白质等,可作为细胞间信息交换的媒介,在进入靶细胞后调控靶细胞功能。课题组在前期研究中发现通过非接触式共培养USCs和NPCs,可促进NPCs增殖并提高ACAN、COL2等基因及对应蛋白的表达,因此我们通过本实验验证外泌体在这一过程中的作用。目的:基于上述内容,我们在本研究中使用了USC-Exos体外干预退变的髓核细胞,旨在探索USC-Exos体外干预下是否可促进NPCs增殖及其对髓核细胞ACAN、COL2、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)、多肿瘤抑制基因P16(P16)基因mRNA及对应蛋白的表达有何影响。方法:从健康成人尿液中获得USCs并进行体外培养,通过成骨、成软骨、成脂诱导分化及WB技术对所提取细胞进行鉴定。采用差速离心法从USCs完全培养基中提取外泌体。使用电子显微镜、粒径分析及WB技术进行外泌体的鉴定。使用USC-Exos对P6 NPCs进行干预,CCK-8法检测细胞增殖,使用PKH26荧光染料标记外泌体,并在激光共聚焦显微镜下观察NPCs对USC-Exos的摄取情况。随后进行β-半乳糖苷酶衰老染色和ACAN、COL2免疫荧光染色。用RT-PCR和WB检测NPCs中ACAN、COL2、TIMP1、P16基因mRNA及对应蛋白的表达量;将ACAN、COL2、TIMP1、P16基因的相对表达量按分组进行组间单因素方差分析,P<0.05为有统计学差异。结果:提取的USC-Exos为50～100nm的椭圆形囊泡结构,其表达CD63和Tsg101,不表达Calnexin蛋白。经PKH26标记的USC-Exos可被NPCs摄取;经USC-Exos干预后P6 NPCs增殖速度变快且衰老细胞比例降低;细胞中ACAN、COL2、TIMP1基因mRNA及对应蛋白的相对表达量在3d、5d、7d时实验组较对照组显著升高(P<0.05),P16基因mRNA及对应蛋白的相对表达量在3d、5d、7d时实验组较对照组显著降低(P<0.05)。结论:USC-Exos在体外条件下可促进退变NPCs的增殖,提高退变NPCs ACAN、COL2、TIMP1基因及对应蛋白质的表达,并降低P16基因及对应蛋白质的表达。

关键词： 雨课堂   细胞生物学   教学改革实践  

摘要： 当代大学生对网络和智能手机有一种天然的亲近,传统课堂教学已经不能满足他们对知识获取途径和方法的要求。通过对《细胞生物学》课程实行教学改革实践研究,初步探讨了"雨课堂"在《细胞生物学》课程教学改革中的应用实践,包括借助"雨课堂"课前教师可以将带有图片、习题的预习课件和音频视频推送到学生手机端,让学生自主完成预习,课上通过随机点名、弹幕投稿互动等手段,抽查学生对知识点的掌握情况,起到了很好地教学互动效果,课后后台教学日志提供了大量的数据,教师基于该数据对教学效果进行考察,学生复习时可以查阅所有学习资料。在《细胞生物学》课程教学过程中采用"雨课堂"教学工具后,很大程度地改善了学生的学习体验,拓宽了学生知识面、提高了学生分析问题和解决问题的能力、调动了学生学习的积极性。该实践有效提高了学习成绩和优秀率,取得了理想的教学效果。

关键词： 乳腺癌   间质干细胞   胞外囊泡   上皮-间质转化   ERK信号通路  

摘要： 目的:乳腺癌是我国女性中最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均处于女性恶性肿瘤的首位,严重危害女性的生命健康。随着医学技术的发展,目前临床上乳腺癌的治疗方法主要包括外科手术治疗、放化疗、内分泌治疗等,虽然在乳腺癌疾病的早期诊断和治疗措施方面得以改善,但未能降低乳腺癌的死亡率。因此,探讨如何提高对乳腺癌的治疗水平具有重要的临床意义。目前,随着间质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)在肿瘤治疗中的潜在价值得到了越来越多研究者的关注,现研究表明MSCs可通过其分泌体参与肿瘤进展和肿瘤微环境的调节。胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是由多种类型的细胞分泌的膜性纳米囊泡,在生理和病理条件下都能介导细胞间的通讯。然而,关于它们相互作用的潜在机制和功能,仍然存在许多未解之谜。本研究旨在探讨人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)来源的EVs(hUCMSC-EVs)对人乳腺癌细胞增殖、迁移的影响及机制研究。方法:(1)从医院取来新鲜的脐带组织,采用组织块贴壁法分离培养hUC-MSCs,观察hUC-MSCs形态特征;用成骨诱导液和成脂诱导液来鉴定hUC-MSCs的多向分化潜能;流式细胞术鉴定hUC-MSCs的表面标记;(2)差速超速离心法提取hUC-MSC-EVs;透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察hUC-MSC-EVs形态;Nanosight检测hUC-MSC-EVs的粒径分布;流式细胞术和Western blot检测hUC-MSC-EVs表面蛋白CD63、CD81的表达情况;(3)通过免疫荧光观察hUC-MSC-EVs被MCF-7和MDA-MB-231内化过程;(4)通过MTT和平板克隆形成实验检测hUC-MSC-EVs对MCF-7和MDAMB-231两种乳腺癌细胞株的增殖影响;通过划痕实验和Transwell实验检测hUCMSC-EVs对乳腺癌细胞迁移和侵袭作用;利用Western blot检测hUC-MSC-EVs对乳腺癌细胞的p-ERK、N-cadherin、E-cadherin等蛋白的表达情况;(5)通过平板克隆形成实验观察hUC-MSC-EVs对ERK抑制剂U0126处理后的乳腺癌细胞增殖的影响;通过划痕实验和Transwell实验检测hUC-MSCEVs对ERK抑制剂U0126处理后的乳腺癌细胞迁移和侵袭作用;利用Western blot检测hUC-MSC-EVs对ERK抑制剂U0126处理后乳腺癌细胞的p-ERK、Ncadherin、E-cadherin等蛋白的表达情况;结果:(1)经过分离培养,镜下可见细胞形态为长梭形,呈漩涡样生长;通过成骨诱导液诱导14天后,经ALP染色可见红色钙结节;通过成脂诱导液诱导21天后,经油红O染色可见橘红色的脂滴;流式细胞术结果显示CD45、CD19、CD34为阴性表达,而CD105、CD90、CD29为阳性表达,其符合MSCs的一般表面标志;(2)镜下观察hUC-MSC-EVs呈单个或者是成堆聚集分布的膜性纳米级囊泡,呈椭圆或碟状结构,中心低密度,直径在几十到几百不等;通过流式细胞术和Western blot检测hUC-MSC-EVs表面标记发现其表达CD63和CD81,也是符合EVs的一般表面标记;(3)免疫荧光证实了hUC-MSC-EVs可以被MCF-7和MDA-MB-231细胞内化;(4)通过MTT和平板克隆形成实验以及划痕实验和Transwell实验结果显示,hUC-MSC-EVs处理后的MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显增强;而加入ERK抑制剂U0126后,乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力下降;(5)Western blot结果显示随着hUC-MSC-EVs浓度的增加,p-ERK表达增加,E-cadherin表达降低,N-cadherin表达增加;而加入ERK抑制剂U0126后,p-ERK表达减少,E-cadherin表达增加,N-cadherin表达降低。结论:hUC-MSC-EVs通过ERK途径诱导EMT促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移潜能,从而导致恶性肿瘤进展和转移。这项研究提示,针对逆转EMT的途径可能会开发新的治疗方法来对抗乳腺癌。

关键词： 细胞生物学   研究  

ISBN: (纸本)9787030603463

摘要： 本书在此基础上进行拓展并增加了自噬的内容，以反映过去10多年来该领域的快速发展，系统而深入地介绍该领域的基本理论、实验技术及应用前景，共29章。

关键词： 紫檀芪   动脉粥样硬化   内皮细胞   半酰胺酸天冬氨基酸蛋白酶   细胞凋亡   核因子E2相关因子2   TLR4/MyD88/NF-κB信号通路  

摘要： 目的:充分探讨紫檀芪对核相关因子Nrf2在动脉粥样硬化疾病中调控性作用以及其与TLR-4/MyD88/NF-κB信号通路之间的关联性,探究紫檀芪改善动脉粥样硬化疾病的病理机制。材料与方法:随机选取成年SD大鼠60只,采取主动脉内皮损伤方法制备大鼠动脉粥样硬化损伤模型,将大鼠随机分成以下几组:Control组（大鼠腹腔内注射生理盐水）;Nrf2-p组（大鼠腹腔内注射Nrf2拮抗剂）;Pterostilbene组（大鼠灌胃紫檀芪溶液）;Pterostilbene+Nrf2组（大鼠灌胃紫檀芪+Nrf2激动剂）。大鼠继续培养4周,悉数将大鼠处死,进行相关项目分析:各组大鼠大体情况分析;形态学分析:HE染色分析各组大鼠主动脉内皮细胞形态;免疫组织化学染色、免疫荧光染色分析各组大鼠主动脉内皮细胞中Nrf2、Survivin、Bax、Bcl-2蛋白浓度阳性率表达;ELISA检测各组大鼠主动脉内皮细胞中TNF-α、IL-6、IL-1及IL-1β中浓度表达;细胞增殖与凋亡:CCK-8检测各组大鼠主动脉内皮细胞增殖趋势;Annexin V-FITC/PI双染法检测各组大鼠主动脉内皮细胞凋亡率;线粒体指标分析:线粒体膜电位分析及ATP合成能力定量分析;ROS活性氧分析;双荧光素酶检测系统检测各组大鼠主动脉内皮细胞Nrf2、TLR-4/MyD88/NF-κB信号通路关键蛋白、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白活性表达;TEM检测各组大鼠主动脉内皮细胞中凋亡小体分析;RT-PCR检测各组大鼠主动脉内皮细胞中Bax、Bcl-2、Survivin、Nrf2蛋白mRNA分析;Western-blot检测各组大鼠主动脉内皮细胞中Bax、Bcl-2、Survivin、Nrf2、TLR-4/MyD88/NF-κB信号通路关键蛋白浓度表达分析。结果:各组大鼠体重变化:2周（造模）以内,各组大鼠体重增长幅度较低,大鼠体现出较缓的生长模式,在分组处理后3周6周各组大鼠的生长趋势差异性较大,比较趋势为Nrf2-p0.05,数据差异不具有统计学意义;血清相关指标分析:血脂水平分析TC、TG、LDL-2浓度变化体现出相同的趋势,各组数据比较为Pterostilbene+Nrf2

关键词： ARLA1A   VPS41   ABA   胁迫响应  

摘要： ARL8B为进化过程中保守的Arf-like类小G蛋白。在动物细胞中,ARL8B的细胞生物学功能已经得到了相对广泛的研究。ARL8B在动物细胞中可以通过调控HOPS复合体亚基VPS41来介导晚期内吞体与溶酶体的膜融合过程以及介导溶酶体向细胞外周的转运过程。虽然,但ARL8B在拟南芥中的同源蛋白ARLA1A是否具有保守的功能目前还不清楚。本课题通过生化、遗传和细胞生物学实验证实了ARLA1A也能与植物中的VPS41互作,并且二者在细胞中的点状结构上共定位,而且在过表达ARLA1A的组成型激活形式的背景下,一部分VPS41也转移到了细胞膜上,说明在拟南芥中ARLA1A可能也参与对VPS41的调控。然而,共定位分析和药理学实验结果显示ARLA1A不定位在典型的晚期内吞体/液泡前体上,并具有独立于VPS41之外的细胞生物学特征,这与ARL8B在动物细胞中的亚细胞定位以及参与的细胞生物学过程不同,暗示着植物中ARL8B同源蛋白在进化过程中可能演化出植物特有的功能。生理学实验结果表明ARLA1A亚细胞分布受ABA调控,在ABA处理下会转移到细胞膜以及液泡膜上,过表达ARLA1A组成型激活突变蛋白的植株的主根生长对ABA胁迫处理更具抗性并且ARLA1A过表达组成型激活突变蛋白会明显抑制ABA下游调控基因的转录水平,这些结果说明ARLA1A可能参与ABA胁迫响应过程。综上所述,我们的研究表明,植物中的ARLA1A与动物中的ARL8B相比既具有保守的功能,同时也在进化过程中演化出了植物特有的功能。

关键词： 压电效应   钛酸钡   低强度脉冲超声波   成骨作用   钙离子  

摘要： 目的:研发人工骨植入材料仍然是临床和实验室研究的热点。钛和钛合金因其良好的生物相容性、优良的机械特性和耐腐蚀性广泛应用于各种骨替代材料。但由于钛合金是惰性金属,不能提供有利于周围骨组织生长的生物微环境,常常导致骨植入材料的愈合时间长甚至失败。通过材料表面修饰的方法,在保持其良好的机械性能的同时,可以赋予钛合金生物活性,提高宿主组织的生物学反应。骨组织的再生和重塑过程需要多种生理信号,包括生化、电和机械共同作用以确保功能恢复。人体骨骼是一种“压电材料”,在受到机械力作用时,其产生的微电环境能够促进骨形成和骨重塑。压电材料可以模拟骨的压电性质,承受载荷时,不需要外部电源就能向细胞或受损组织提供电刺激。钛酸钡（barium titanate,BT）压电陶瓷是一种生物相容性和压电性能良好的压电材料。本研究拟在Ti6Al4V（titanium-6aluminum-4vanadium,TC4）表面原位合成BT压电陶瓷涂层,形成BT/TC4复合材料,将TC4材料的机械性能和BT压电陶瓷的压电性能结合起来。同时,低强度脉冲超声波（low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS）是一种近年来比较受认可的促进骨愈合修复的物理刺激方法,其本身是一种机械波,可以利用LIPUS的机械性能,实现动态机械力学加载,拟激发BT/TC4材料的电信号,模拟骨的电生理过程。本研究拟通过水热合成法将BT压电陶瓷涂层制备于TC4表面,制备BT/TC4复合材料,首先评价材料的表面形貌、电学性能和生物相容性。再将LIPUS作用于BT/TC4复合材料,研究材料表面小鼠前成骨细胞（mouse embryo osteoblast precursor cells,MC3T3-E1）的生物学反应,并初步揭示其反应机制,为“压电材料结合超声”这一治疗方法的临床应用提供基础数据。研究方法:第一部分:水热合成法在TC4基底材料表面制作BT压电陶瓷涂层（BT/TC4材料）;通过扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）和能量弥散X射线谱（energy-dispersive X-ray spectroscopy,EDS）对BT/TC4材料形貌和元素的检测,评价水热合成法制备BT压电陶瓷涂层的效果;通过X线衍射技术（X-ray crystallography,XRD）分析BT/TC4材料晶体相结构;介电测试仪测量BT/TC4材料的介电常数,电化学工作站测量TC4和BT/TC4两种材料在有无超声波（频率:1MHz;强度:30m W/cm2）作用时的电流值,评价BT/TC4材料的电学性能。通过细胞增殖检测试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）检测MC3T3-E1细胞在两种材料表面的增殖,评估BT/TC4材料的生物相容性。第二部分:将MC3T3-E1细胞在材料表面复合培养,随机分为超声BT/TC4组、超声TC4组、对照BT/TC4组和对照TC4组四组。通过实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,qPCR）检测各组相关成骨指标基因碱性磷酸酶（alkaline phosphatese,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OCN）和Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2,Runx-2）mRNA的相对表达量,通过蛋白免疫印迹技术（western blot,WB）检测各组成骨指标ALP、Runx-2和Ⅰ型胶原（type I collagen,Col1）蛋白表达水平,探究LIPUS作用于BT/TC4材料对表面MC3T3-E1细胞成骨作用的影响;通过液相层析串联质谱（Liquid Chromatograph-mass Spectrometer,LC-Mass）非靶向代谢组学方法筛选差异代谢物,探究LIPUS作用于BT/TC4材料对表面MC3T3-E1细胞代谢物表达的影响;通过生物信息学分析对差异表达的代谢物进行KEGG Pathway功能富集分析。第三部分:将MC3T3-E1细胞在材料表面复合培养,随机分为超声BT/TC4组、超声TC4组、对照BT/TC4组和对照TC4组。通过钙离子成像技术检测7d时各组MC3T3-E1细胞内钙离子浓度,比较四组MC3T3-E1细胞内钙离子浓度的变化;将上述每一组再分别随机分为空白组、L型钙离子通道阻滞组（维拉帕米组）和钙库阻滞组（SKF-96365组）,1d时通过钙离子成像技术观察在有无阻滞剂添加后,四组MC3T3-E1细胞内钙离子浓度的差异性是否消失;通过WB检测7d时各组MC3T3-E1细胞的Ca V1.2蛋白的表达水平,通过qPCR检测MC3T3-E1细胞内Ca V1.2mRNA的相对表达

关键词： 肝癌细胞   二甲双胍   塞来昔布   哺乳动物雷帕霉素靶蛋白   金属硫蛋白  

摘要： 目的:二甲双胍是2型糖尿病治疗的一线药物,近年来因被发现具有抗肿瘤作用而成为研究的热点。塞来昔布是选择性抑制环氧化酶-2（COX-2）的非甾体抗炎镇痛药,COX-2的过表达被大量证实与促进肿瘤的发生发展有关。本研究拟探讨二甲双胍联合塞来昔布对人肝癌细胞HepG2和Huh7增殖、侵袭和迁移的影响,并初步研究其作用机制,为其在临床应用于抗肿瘤辅助药物提供实验室依据。方法:1.将肝癌细胞HepG2和Huh7分为对照组、二甲双胍组、塞来昔布组和联合用药组,根据实验要求分别进行培养。利用Hoechst33258染色法观察细胞凋亡;CCK-8法检测细胞增殖情况,并采用Chou-Talalay法计算联合用药指数（combination index,CI）。2.利用划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell侵袭小室实验检测细胞侵袭能力;蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）检测AMPK、PI3K、Akt、m TOR蛋白表达情况。3.选择4周龄雄性裸鼠16只,将肝癌细胞Huh7混悬于PBS溶液制备成密度为5*10～7/ml的细胞悬液,用1ml一次性无菌注射器抽取200μl皮下注射于裸鼠左侧背部肩胛处,建立移植瘤动物模型。9天后当裸鼠皮下移植瘤体积>100mm3时即建模成功,将所有荷瘤裸鼠随机分为对照组（生理盐水）,二甲双胍组（250mg/kg）,塞来昔布组（3mg/kg）和联合用药组（250mg/kg+3mg/kg）,每组各4只,以3天/次的频率经尾静脉注射给药,并记录裸鼠的体重和成瘤大小。在第43天处死裸鼠,分离皮下肿瘤,用4%多聚甲醛固定液固定24小时后包埋制成蜡块,通过免疫组织化学染色观察Ki-67表达情况,并用TUNEL检测法检测细胞凋亡情况。4.将肝癌细胞HepG2和Huh7分为对照组、二甲双胍组、塞来昔布组和联合用药组培养48小时后,基于Illumina测序平台进行转录组测序（m RNA）,分析各组间基因表达差异并进行筛选。利用q PCR验证差异基因MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1M在表达趋势是否与测序结果一致。结果:***33258染色结果显示,与对照组相比,二甲双胍和塞来昔布作用于HepG2和Huh7细胞后,细胞逐渐圆缩,细胞核崩解,凋亡细胞增多,细胞增殖速度降低。CCK-8结果显示,二甲双胍和塞来昔布均能抑制HepG2及Huh7细胞的增殖,并且作用强度呈时间-浓度依赖性,其中二甲双胍对HepG2和Huh7细胞48小时的IC50分别为80mmol/L和25mmol/L,塞来昔布对HepG2和Huh7细胞48小时的IC50分别为25μmol/L和50μmol/L;双药联合用药时对细胞增殖抑制作用较单药时更明显,在48小时的IC50为HepG2:40mmol/L+12.5μmol/L,Huh7:6.25mmol/L+12.5μmol/L。通过Chou-Talalay联合指数法计算得出二甲双胍与塞来昔布存在协同作用,其在HepG2的CI值为0.65,在Huh7的CI值为0.27。2.划痕实验结果显示,二甲双胍和塞来昔布作用后细胞迁移能力明显下降（P<0.05）,联合用药效果更为显著。Transwell侵袭小室结果显示,单药用药时HepG2和Huh7细胞侵袭能力降低,在联合用药时侵袭能力受显著抑制（P<0.05）。WB结果显示,联合用药组HepG2细胞内AKT、AMPK、m TOR表达水平呈下降趋势,PI3K表达水平先下降,后上升;Huh7细胞内AKT、AMPK、PI3K、m TOR表达水平均呈下降趋势。3.二甲双胍和塞来昔布都能抑制裸鼠皮下肿瘤生长,联合用药时抑制效果显著。免疫组化结果显示Ki-67在联合用药组阳性率最低,TUNEL检测结果显示联合用药组细胞凋亡阳性率最高。4.转录组测序结果显示,联合用药时MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1M基因表达明显上调（P<0.001）。q PCR验证结果与测序结果趋势相符。结论:体外细胞实验表明二甲双胍可协同塞来昔布增强对HepG2和Huh7细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用。体内动物实验表明二甲双胍联合塞来昔布可以增强对裸鼠皮下成瘤的抑制作用。两药之间存在协同作用,可能与m TOR信号通路的抑制和MTs蛋白的激活有关。