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关键词： 胃癌   长链非编码RNA   BBOX1-AS1   增殖   周期  

摘要： 胃癌位于全球癌症发病率第五位,死亡率第四位,是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一。目前,胃癌的发生和发展分子机制尚不明晰。既往研究表明多种lncRNA在胃癌中异常表达,并在胃癌的发生发展过程中发挥癌基因或抑癌基因作用。因此探索胃癌相关新型lncRNA的生物学功能和分子作用机制对阐明胃癌发生发展机制有着重要作用。目的:通过生物信息学的方法筛选胃癌中差异表达的lncRNA,并探索BBOX1-AS1在胃癌中的生物学功能和分子作用机制。方法:从GEO数据库下载胃癌相关数据集GSE53137、GSE70880和GSE99417,从TCGA数据库下载TCGA?STAD转录组数据及患者临床信息,采用R软件筛选差异表达的lncRNA。统计分析TCGA?STAD数据集中BBOX1-AS1在胃癌组织和胃正常组织中的差异表达,并分析BBOX1-AS1表达与胃癌临床病理特征的关系。采用GSEA分析BBOX1-AS1的生物学功能。通过RT-qPCR测定BBOX1-AS1在25对人胃癌组织及癌旁组织中的表达水平,并检测BBOX1-AS1在人源正常胃上皮细胞系GES-1和四种人源胃癌细胞系BGC823、AGS、MGC-803和HGC-27中的表达水平。利用FISH技术分析BBOX1-AS1的亚细胞定位。构建BBOX1-AS1敲降模型(采用高表达BBOX1-AS1的胃癌细胞系HGC27细胞),构建BBOX1-AS1过表达模型(采用低表达BBOX1-AS1的胃癌细胞系BGC823细胞),CCK-8验证BBOX1-AS1对胃癌细胞增殖能力的影响,克隆形成实验检测BBOX1-AS1对胃癌细胞克隆形成能力的影响,transwell迁移实验测定BBOX1-AS1对胃癌细胞迁移能力的影响,流式细胞术检测BBOX1-AS1对胃癌细胞周期进程和凋亡的影响,WB实验检测细胞周期相关蛋白CDK4和cyclin D1的表达水平。利用在线软件JASPAR和LASAGNA Search 2.0预测cyclin D1启动子区域的潜在结合转录因子及其结合位点。WB实验检测STAT3途径相关蛋白磷酸化STAT3和STAT3蛋白表达水平。结果:从GEO数据库胃癌相关数据集(GSE53137、GSE70880和GSE99417)和TCGA?STAD转录组数据中取交集筛选出15个差异表达的lncRNA。结合TCGA?STAD转录组数据,进一步分析显示BBOX1-AS1在胃癌组织中显著高表达。BBOX1-AS1表达与胃癌临床病理特征相关性分析结果显示,相较于高分级的胃癌组织,BBOX1-AS1在低分级的组织中表达显著增高。GSEA分析表明,BBOX1-AS1与癌症相关,可能参与MAPK、JAK/STAT和WNT等信号通路。RT-qPCR结果表明,与癌旁组织相比,BBOX1-AS1在人胃癌组织显著高表达;且BBOX1-AS1在四种人源胃癌细胞系BGC823、AGS、MGC-803和HGC-27中表达高于人源正常胃上皮细胞系GES-1。FISH结果显示BBOX1-AS1在细胞质和细胞核中均表达。CCK-8结果提示沉默BBOX1-AS1抑制胃癌细胞的增殖,而过表达BBOX1-AS1则促进胃癌细胞的增殖。克隆形成实验证明沉默BBOX1-AS1抑制胃癌细胞的克隆形成能力,而过表达BBOX1-AS1则促进胃癌细胞的克隆形成能力。Transwell迁移实验证实沉默BBOX1-AS1显著抑制胃癌细胞的迁移能力,而过表达BBOX1-AS1显著促进胃癌细胞的迁移能力。流式细胞术和WB实验结果提示,沉默BBOX1-AS1后,细胞周期停滞在G1期,并且抑制CDK4和cyclin D1的蛋白表达水平,而过表达BBOX1-AS1促进G1/S细胞周期转化,并且促进CDK4和cyclin D1的蛋白表达水平。JASPAR和LASAGNA Search 2.0网站在线分析显示转录因子STAT3在cyclin D1启动区域有多个结合位点。此外,沉默BBOX1-AS1可降低胃癌细胞中磷酸化STAT3和STAT3蛋白表达水平,而过表达BBOX1-AS1则促进胃癌细胞中磷酸化STAT3和STAT3蛋白表达水平。结论:BBOX1-AS1在胃癌中高表达,促进胃癌细胞的增殖、迁移和细胞周期进程,可能通过激活STAT3途径促进胃癌发展,并且可能成为胃癌的潜在治疗靶点。

关键词： 医学细胞生物学   课程思政   教学改革   医学教育  

摘要： "课程思政"是加强高等学校大学生思想政治教育和促进学生全面发展的重要途径,为更好地发挥"课程思政"的协同育人效应,结合医学细胞生物学的课程特点,在基础理论课课堂隐性的融入思政教育,包括爱国意识、法治意识、科学精神、团队合作、奉献精神等,使"知识传授"与"价值引领"同行并重,目的在于培养德才兼备的应用型医学人才。

关键词： 食管胃结合部腺癌   Involucrin   氨基酸突变   二代测序  

摘要： 目的:检测食管胃结合部腺癌（adenocarcinoma of the esophagogastric junction,AEG）患者基因突变情况,分析内披蛋白（Involucrin,IVL）突变对肿瘤细胞生物学功能的影响。方法:1.山西地区AEG患者全外显子组测序和ivl突变分析收集山西省肿瘤医院普通外科手术切除的22例山西地区AEG患者的癌组织和癌旁组织,运用二代测序技术进行全外显子组测序,分析ivl的突变种类并筛选ivl突变位点;整理汇总TCGA数据库中食管癌ivl的突变情况,进行GO功能注释和KEGG富集分析。2.过表达KYSE150细胞中的IVL对细胞功能的影响构建人IVL过表达质粒,转染食管癌细胞KYSE150,使用q RT-PCR和Western Blot检测过表达效率,MTT法检测细胞增殖能力,划痕愈合实验测定细胞迁移能力的变化。3.突变寡肽与转谷氨酰胺酶1（TGase1）的结合能力体外合成5种不同氨基酸突变位点的IVL寡肽,通过体外活性测试分析寡肽与TGase1的结合能力。结果:对22例山西AEG患者的癌和癌旁组织进行全外显子测序,发现突变率位于前十位的基因分别是tp53、ttn、muc16、nalcn、ivl、lama5、neb、obscn、pclo、robo1。测序发现山西地区食管胃结合部腺癌中ivl突变率高达18%;在4例AEG肿瘤样本中发生了5处ivl突变,皆为错义突变;。GO分析显示ivl突变与上皮细胞分化、细胞分化调控的活性等生物学过程有关;KEGG信号通路分析显示ivl突变与c AMP信号通路等途径有关。过表达IVL可抑制食管癌细胞的增殖和迁移能力,突变型IVL寡肽与TGase1的结合能力弱于野生型寡肽。结论:IVL重复基序第七位氨基酸谷氨酰胺的突变减弱IVL与TGase1的结合,影响多种与肿瘤相关的生物学过程和信号通路。

关键词： 卵巢癌   RPL34   SKOV3   增殖   侵袭   迁移  

摘要： 卵巢癌（OC）是女性最常见的恶性肿瘤之一。由于缺乏有效的诊断方法,再加上缺乏可靠的体征和症状,早期卵巢癌的检测十分困难。同时,卵巢癌预后不良,复发率高,并伴有晚期转移,导致死亡率高。因此,有必要进一步研究其内在机制,开发潜在的卵巢癌治疗靶点,改善患者预后,降低死亡率。哺乳动物核糖体由一个60S的大亚基和一个40S的小亚基组成,主要成分是核糖体RNA（r RNA）和核糖体蛋白（RPs）。核糖体蛋白是核糖体的重要组成部分,参与蛋白质翻译和核糖体组装,是所有类型细胞生长和存活所必需的。以往的研究表明,核糖体蛋白在调节各种生理和病理过程中发挥着重要作用。它不仅参与DNA转录、基因翻译、DNA修复和细胞形态维护,还参与调控生长、增殖、周期、凋亡、转移和侵袭,甚至与正常细胞的恶性转化高度相关。核糖体蛋白已被发现在食管癌、胃癌、肺癌等多种癌症的发生发展中发挥重要作用,是靶向治疗癌症研究的热点。核糖体蛋白L34（RPL34,RPs的L34E家族）主要参与60S亚基的形成,位于细胞质中,含有锌指结构。近期研究表明,RPL34作为肿瘤启动子参与了人类恶性肿瘤的发生发展。有研究表明,高表达的RPL34提示预后不良,对其敲除可能抑制肿瘤的增殖和生长,其中包括非小细胞肺癌,骨肉瘤,口腔鳞状细胞癌,胃癌,食道癌,结肠直肠癌,胰腺癌和神经胶质瘤。然而,RPL34在卵巢癌中的生物学功能和临床意义尚不清楚。因此,本研究的目的是探讨RPL34在卵巢癌进展中的作用。通过查阅ONCOMINE网站发现RPL34在卵巢癌组织中的表达水平低于交界性卵巢表面上皮-间质瘤。由于样本量较小,这一结论还需要进一步验证。因此,仍需通过体内和体外实验进一步探讨RPL34在卵巢癌中的表达及功能。在本研究中发现RPL34在卵巢癌中低表达,而过表达RPL34抑制了卵巢癌的增殖、迁移和侵袭。数据表明,RPL34低表达与卵巢癌的进展有关,可能为卵巢癌的治疗提供一个新的分子标记。目的本研究旨在探究RPL34在卵巢癌组织和细胞中的表达,以及RPL34对SKOV3细胞增殖、迁移、侵袭的影响,为卵巢癌寻找新的治疗靶点。方法1.筛选2018年1月至2020年1月期间在郑大三附院被确诊为卵巢癌的病例共30例及卵巢囊肿的病例共20例。2.利用免疫组化技术检测RPL34在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达情况。3.利用qRT-PCR检测RPL34 mRNA在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达水平,及RPL34 mRNA在卵巢癌细胞和正常卵巢上皮细胞中的表达水平。4.荧光显微镜观察,Western blot和qRT-PCR检测以慢病毒为载体介导的RPL34-sh RNA和RPL34-OE转染SKOV3细胞后,RPL34的表达情况。5.通过CCK-8增殖实验,单细胞克隆实验检测RPL34对SKOV3细胞增殖能力的影响。6.通过细胞划痕实验,检测RPL34对SKOV3细胞迁移能力的影响。7.通过细胞侵袭实验,检测RPL34对SKOV3细胞侵袭能力的影响。8.通过流式细胞术,检测RPL34对SKOV3细胞周期和凋亡的影响。9.通过裸鼠皮下成瘤实验,检测在体内RPL34对卵巢癌组织生长的影响。结果1.免疫组化结果显示,RPL34的表达主要定位在细胞浆中。RPL34在卵巢癌组织中的阳性率为36.67%（11/30）,在正常卵巢组织中的阳性率为76.67%（23/30）(χ2=9.774,P<0.05)。通过对比RPL34蛋白质的表达水平和卵巢癌患者的病理资料,发现RPL34的表达与卵巢癌的分化程度（P<0.001）,FIGO分期（P<0.001）和淋巴结转移（P=0.007）密切相关,但与患者年龄或CA125水平没有显著相关性。Kaplan-Meier生存曲线显示,RPL34高表达患者的生存期比RPL34低表达患者的生存期长。2.在分子水平检测RPL34 mRNA的表达,结果显示,RPL34在卵巢癌组织中的表达水平低于正常卵巢组织;RPL34在卵巢癌细胞中的表达水平低于人正常卵巢上皮细胞。3.采用CCK-8法检测RPL34对SKOV3细胞增殖的影响,结果显示,上调RPL34的表达,SKOV3细胞的增殖受到显著抑制,而下调RPL34则相反。4.采用单细胞克隆实验研究RPL34对SKOV3细胞生长的长期影响。结果显示,上调RPL34降低了SKOV3细胞的集落形成能力,而下调RPL34,结果相反。5.采用细胞划痕实验检测RPL34对SKOV3细胞的迁移能力的影响。细胞划痕实验结果显示,上调RPL34后SKOV3细胞的迁移距离明显短于对照组,而下调RPL34的SKOV3细胞迁移距离则长于相应的对照组。6.采用Transwell细胞侵袭实验检测RPL34对SKOV3细胞的侵袭能力的影响。实验结果显示,上调RPL34后,SKOV3细胞穿

关键词： 三阴性乳腺癌   CNB   LINC00514   增殖   侵袭   miRNA   靶点蛋白  

摘要： 研究背景三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中三种重要受体表达缺失的亚型,即雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体-2(HER-2)不表达。与其他乳腺癌亚型相比,TNBC患者的生存时间较短,确诊后5年内死亡率高。TNBC具有高侵袭性,患者易出现远处转移,常累及脑和内脏器官。TNBC因其部分靶点受体的缺失,对目前治疗恶性肿瘤的常规方案存在不敏感的问题。TNBC当前重点依靠全身治疗,而常规术后辅助放、化疗对此类型乳腺癌疗效较差,易出现肿瘤复发和转移。因此,深入探讨TNBC的复发及转移的分子机制从而提供更有效的干预靶点具有重要价值。与TNBC相关LncRNA、miRNA和mRNA的相互作用以及相关的分子机制研究较少,因此,有必要深入探讨与TNBC相关基因调控网络的机制和相互作用,包括LncRNA、miRNA、基因突变和TNBC的进展关联。LINC00514作为新发现的LncRNA,在一些恶性肿瘤中出现异常高表达,对于癌症的发生、发展起到促进和调控作用,但关于LINC00514在TNBC中的生物功能和调控机制尚未见研究报道,因此本研究拟以LINC00514为研究目标,通过一系列生化技术对其在TNBC中的生物功能和分子机制进行探索。研究目的本研究的核心目的是阐明LINC00514在乳腺癌中的生物调控作用及其相关信号机制,主要分为三部分:(1)揭示LINC00514在TNBC中的表达意义及生物功能。探索LINC00514在TNBC临床组织样本和细胞株的表达,分析LINC00514的表达与患者临床指标的关联性,通过改变LINC00514在细胞株中的表达,分析其对TNBC生物增殖、侵袭和凋亡等生物学特性的影响;(2)揭示LINC00514靶向miR-6504-5p和miR-3139调控乳腺癌中的生物功能。通过预测TNBC中LINC00514的下游靶点并进行验证,探索LINC00514下游靶点miR-6504-5p和miR-3139对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响;(3)揭示 LINC00514/miR-6504-5p 和 miR-3139/CCDC71L 信号轴调控TNBC的机制。通过预测miR-6504-5p和miR-3139的下游靶点并进行验证,探索 LINC00514/miR-6504-5p 和 miR-3139/CCDC71L信号轴对TNBC生物功能的影响,lncRNA-miRNA-mRNA相互作用网络为TNBC的进一步实验研究和生物标志物挖掘提供了新的方向,最终为乳腺癌的临床疗效改善提供更有意义的作用靶点。研究方法本研究以52例入组的TNBC患者肿瘤组织和多种TNBC细胞株为研究对象;采用RT-qPCR检测TNBC组织和细胞中LINC00514、miR-6504-5p、miR-3139 和 CCDC71L mRNA 的相对表达;运用 Western blot技术检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和CCDC71L在TNBC组织和细胞中的表达;并用shRNA转染TNBC细胞干扰lncRNA的表达,用miRNA mimics或者inhibitor转染TNBC细胞改变细胞中miRNA的表达,采用pcDNA3.1表达载体转染TNBC细胞上调CCDC71L的表达,用EdU标记实验和克隆形成实验以检测TNBC细胞的增殖能力,采用流式细胞术以检测TNBC细胞的凋亡比例、Transwell实验检测TNBC细胞的侵袭能力、划痕实验以检测TNBC细胞的迁移能力,运用在线数据库Starbase预测LINC00514的下游miRNA靶点、预测miRNA的下游mRNA,采用荧光素酶报告基因实验检测LINC00514和下游miRNA、miRNA和靶点mRNA之间的相互作用。研究结果***组织中LINC00514的表达显著至3.98±1.25,与癌旁组织相比具有统计学差异(n=52,P<0.01)。LINC00514高表达与TNBC患者淋巴结转移(P=0.039)、Ki-67阳性率(P=0.0043)以及临床分期(P=0.008)具有显著相关性。晚期(Ⅲ-Ⅳ期)TNBC患者临床样本中LINC00514表达显著高于早期TNBC患者(Ⅰ-Ⅱ期)(n=52,P<0.01)。***00514在TNBC细胞系中的相对表达显著上调,与人正常乳腺上皮MCF-10A细胞系相比(P<0.001),其中MDA-MB-468细胞(6.54±1.03)和HCC1937细胞(5.52±1.01)的表达水平最高,作为后续的研究模型。3.构建sh-LINC00514并稳定转染TNBC细胞,引起LINC00514的显著下调,在此基础上通过一系列生化技术检测,结果证实,sh-LINC00514的转染显著抑制M

关键词： miR-216b-5p   TRIM44   生物学功能   信号通路  

摘要： 第一部分miR-216b-5p及其预测靶基因TRIM44在肝癌组织和细胞的表达目的和意义研究肝癌组织和细胞中miR-216b-5p的表达水平,预测miR-216b-5p可能调控的靶基因。进一步分析肝癌组织和细胞中靶基因的表达及两者之间的相关性。方法收集30例已经明确诊断的初诊肝癌患者癌组织及癌旁肝组织。体外培养肝永生化细胞(THLE-2)及肝癌细胞(Huh7、Hep G2、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L、LM3),通过荧光定量PCR检测miR-216b-5p在肝癌组织和细胞中的表达水平。通过网站预测分析miR-216b-5p的下游相关靶基因,在肝癌组织和细胞中通过荧光定量PCR或western blot检测靶基因的表达,进一步分析miR-216b-5p和靶基因之间的相关性。结果***-216b-5p在肝癌组织中表达水平是癌旁组织的0.51倍,较癌旁组织显著降低(p=0.001);miR-216b-5p在肝癌细胞中的表达水平均较肝永生化细胞显著降低(p均<0.05),在Hep G2、Hep3B、Huh7、MHCC97H、MHCC97L和LM3中的表达水平分别是肝永生化细胞的0.71倍、0.65倍、0.57倍、0.44倍、0.76倍和0.26倍。2.通过生物信息学网站预测miR-216b-5p的下游靶基因可能为TRIM44。***44 mRNA在肝癌组织表达水平是癌旁肝组织的1.40倍,较癌旁组织显著升高(p=0.004);TRIM44 mRNA在肝癌细胞中的表达水平均较肝永生化细胞明显升高(p均<0.05),在Huh7、Hep G2、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L和LM3中的表达水平分别是肝永生化细胞的1.99倍、1.63倍、1.83倍、2.18倍、1.48倍和2.72倍。***44蛋白在肝癌组织中的表达水平较癌旁组织升高1.22倍,差异具有统计学意义(p=0.033);TRIM44蛋白在肝癌细胞中的表达水平均较肝永生化细胞显著升高(p均<0.05),在Huh7、Hep G2、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L和LM3等6种肝癌细胞中的表达水平分别是肝永生化细胞的1.80倍、1.59倍、1.67倍、2.08倍、1.54倍和2.18倍。5.肝癌组织中miR-216b-5p和TRIM44 mRNA的表达量呈负相关,r=-0.463,p<0.001。结论本部分通过检测肝癌组织和细胞中的miR-216b-5p和TRIM44表达水平发现miR-216b-5p是一个肝癌抑制因子,靶基因TRIM44则是肝癌的促癌基因,二者呈负相关,与生物信息学预测结果一致。第二部分miR-216b-5p对肝癌细胞生物学功能的影响目的和意义采用肝癌Huh7和Hep G2细胞体外分析miR-216b-5p对肝癌细胞生物学功能的影响。方法利用miR-216b-5p mimic和inhibitor瞬时感染肝癌Huh7和Hep G2细胞,分别构建miR-216b-5p高表达和低表达的体外细胞模型。CCK8实验、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验和克隆形成实验分别检测miR-216b-5p对肝癌细胞生物功能的影响。结果1.肝癌Huh7细胞中mimic组的miR-216b-5p相对表达水平显著升高,是mimic-NC组的754.66倍(p=0.003);inhibitor组miR-216b-5p相对表达水平显著降低,是inhibitor-NC组的0.10倍(p<0.001)。肝癌Hep G2细胞中mimic组的miR-216b-5p相对表达水平明显升高,是mimic-NC组的257.60倍(p=0.001);inhibitor组miR-216b-5p相对表达水平明显下降,是inhibitorNC组的0.28倍(p=0.001)。***-8法实验表明miR-216b-5p mimic转染肝癌Huh7和Hep G2细胞24h后,随着时间的推移细胞增殖能力均较mimic-NC组均明显减弱;miR-216b-5p inhibitor转染肝癌Huh7和Hep G2细胞24h后,随着时间的推移细胞增殖能力均较inhibitor-NC组均明显增强。***小室侵袭实验表明miR-216b-5p mimic转染的肝癌Huh7和Hep G2细胞侵袭能力均较mimic-NC组均明显降低(p均<0.001);miR-216b-5p inhibitor转染的肝癌Huh7和Hep G2细胞侵袭能力均较inhibitor-NC组均明显升高(p均<0.001)。4.细胞划痕实验表明miR-216b-5p mimic转染的肝癌Huh7和Hep G2细胞划痕愈合能力均较mimic-NC组愈合速度慢(p均<0.05);miR-216b-

关键词： M2型巨噬细胞   雪旺氏细胞   miR-142-3p   生物学功能  

摘要： 目的:雪旺氏细胞(Schwann Cells,SCs)是周围神经损伤修复的主要效应细胞。而巨噬细胞与SCs的修复活动息息相关,其本身同样具有帮助神经修复的作用。此外,已有研究证实mi R-142-3p参与了周围神经损伤的修复。本课题的目的主要有两个:1.探究M2型巨噬细胞对SCs生物学功能的影响;2.探究mi R-142-3p对SCs生物学功能的影响。方法:1.M2型巨噬细胞与SCs共培养后SCs生物学功能的检测从新生的SD大鼠坐骨神经提取并培养SCs;从成年SD大鼠提取腹腔原代巨噬细胞并分选出M2型巨噬细胞。将两种细胞在Transwell小室种共培养48 h后进行CCK-8、Transwell、RT-q PCR和Westernblot检测SCs和M2型巨噬细胞-SCs共培养中SCs的生物学功能变化。2.抑制或过表达mi R-142-3p的SCs生物学功能的检测将SCs分为mimics(mi R-142-3p过表达)、mimics NC(阴性对照)、inhibitor(mi R-142-3p抑制)和inhibitor NC(阴性对照)组。使用脂质体转染法对SCs进行转染法,RT-q PCR测量各组SCs的mi R-142-3p表达量,确定转染成功后,通过CCK-8、Transwell、Ed U、细胞克隆形成试验、RT-q PCR和Westernblot检测培养至48 h的表达组和抑制组SCs生物学功能变化。结果:1.单独培养的SCs与共培养中SCs的生物学功能的比较共培养组中SCs的增殖、迁移和神经营养因子表达均高于单纯SCs培养组,差异具有统计学意义。2.转染SCs后,各组SCs的生物学功能的比较mi R-142-3p过表达组SCs的增殖、迁移和神经营养因子表达显著高于其对照组,mi R-142-3p抑制组SCs的增殖、迁移和神经营养因子表达明显低于其对照组,差异具有统计学意义。结论:1.M2型巨噬细胞对SCs增殖、迁移及神经营养因子分泌功能具有促进作用;*** R-142-3p对SCs增殖、迁移及神经营养因子分泌功能起促进作用。

关键词： 乳品   雌二醇   维生素D3   胰岛素生长因子1   细胞生物学效应  

摘要： 世界卫生组织的研究数据显示,肥胖和慢性代谢疾病患病率激增。肥胖导致的脂肪异常积累和全身性炎症的发生,进而导致多种癌症发生,也会显著增加癌症患者术后复发风险。然而,肥胖是癌症中可预防的风险因素。乳品富含多种调控机体生长发育的活性物质,有研究表明,充分摄入乳品可有效预防脂肪异常积累引起的代谢综合征及血浆代谢紊乱、肥胖,还可预防癌症的作用。其中生理调控效应最为明显的为雌二醇(E2)、维生素D3(VD3)、胰岛素生长因子1(IGF-1),含量分别为31.43±8.00 pg/m L,35 pg/m L,312–1850 ng/m L。但在此基础上过量和不当补充E2、VD3、IGF-1可能导致发育迟缓、甚至发育停滞隐患。因此,对乳制品中多种营养成分进行生物学效应研究至关重要。针对上述物质单一作用已较为透彻,但对三种物质联合效应研究较为缺乏。本研究主要利用体外乳腺癌细胞(MCF-7)和子宫癌细胞(He La)细胞体外模型,基于生物信息学方法并结合脂质组学技术,对雌二醇、维生素D3、胰岛素生长因子1联合共暴露的生物学效应进行研究,为下一步敏感人群合理膳食提供初步的科学建议。具体结果如下:1、依据美国国立生物技术信息中心(NCBI)关于MCF-7人乳腺癌细胞的3套GEO芯片(GSE160497、GSE27220、GSE145787)进行生物信息学分析,结果发现E2(10nmol/L)、VD3(0.5nmol/L)、IGF-1(100ng/m L)共同作用DNA复制、染色体合成等促进机体生长发育的信号通路,同时可促使乳腺癌标志因子MUC1表达的沉默。E2单独作用可使微小染色体维持蛋白7、核糖体RNA加工蛋白等基因显著下调,而促进MUC1过表达。E2可与VD3、IGF-1互作并维持平衡体细胞代谢,但过量E2可能激活MUC1乳腺癌标志因子通路。2、不同浓度E2、VD3、IGF-1单独和联合对He La、MCF-7细胞增殖影响研究:1)Hela细胞:E2(60nmol/L)、VD3(8nmol/L)、IGF-1(20ng/m L)二元、三元组合作用于He La细胞增殖率均较高;其中当组合中VD3浓度为6.5nmol/L以及8nmol/L时细胞增殖率更为显著(P<0.05),提示He La对VD3敏感更高。MCF-7细胞:E2(30nmol/L)、VD3(2nmol/L)、IGF-1(20ng/m L)二元、三元组合作用于细胞,结果显示MCF-7对E2作用更为稳定,同时较低与较高浓度下细胞增殖率差异不显著(P>0.05)。2)细胞周期影响研究:He La细胞组G2-M期排序为VD3+IGF-1>E2+IGF-1>VD3>E2+VD3+IGF-1>E2>E3+VD3>IGF-1;MCF-7细胞G2-M期排组为IGF-1>E2>E2+VD3>E2+VD3+IGF-1>VD3>VD3>VD3+IGF-1>E2+IGF-1;结果显示,对比二元组合与三元组合G2-M期可发现VD3和IGF-1具有相反调节作用,MCF-7和He La对单一和二元组合作用更为敏感(3)细胞新DNA合成及细胞膜电位变化情况:分别比对He La组:E2(60nmol/L)、VD3(8nmol/L)、IGF-1(20ng/m L)和MCF-7组:E2(30nmol/L)、VD3(2nmol/L)、IGF-1(20ng/m L)当中二元组合作用、三元组合作用情况,结果显示二元组合细胞膜电位变化更加活跃,细胞新DNA合成量与细胞增殖率成正比,与细胞增殖实验结果一致。3、不同浓度的E2、VD3、IGF-1单独和联合作用He La、MCF-7细胞脂质组学研究:E2+VD3或E2+IGF-1在He La细胞、MCF-7细胞中均表现较强的脂质代谢抑制作用。在He La IGF-1(20ng/m L)+E2(60nmol/L)组与MCF-7 E2(30nmol/L)+VD3(2nmol/L)组中以上甘油磷脂表达量较少,反之He La E2(60nmol/L)+VD3(8nmol/L)与MCF-7 IGF-1(20ng/m L)+E2(30nmol/L)组甘油磷脂表达量较高。脂质代谢基因分析结果显示,E2+VD3处理细胞时,CYP24A1、GPER1、PIGP、FABP5、LRP8等脂质代谢关键基因变化显著,其中VD3下调胞内钙离子水平,促进线粒体氧化还原反应降低脂质含量。E2+IGF-1处理细胞时PTGER4、SOCS等为细胞脂质代谢关键基因,IGF-1通过上调胞内JAK激酶活性,促进下游脂质代谢,预防脂质异常积累。

关键词： 子痫前期   胎盘   滋养细胞   SIRT3  

摘要： 背景:沉默信息调节因子3(Silence information regulator 3)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的去乙酰化酶,可通过去乙酰化修饰多种线粒体蛋白,调控线粒体形态与功能,参与能量代谢、ROS清除、细胞周期、细胞内信号传导、侵袭以及迁移等过程。然而,SIRT3在子痫前期发病中作用尚不明确。目的:检测SIRT3在正常妊娠和子痫前期胎盘中表达与定位。研究SIRT3对滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞功能的影响。通过构建滋养细胞氧化应激模型,探讨PE中SIRT3改善氧化应激的可能机制。方法:通过免疫组织化学法和Western blotting来检测早、中、晚孕期正常妊娠以及早发型子痫前期(eo PE)和晚发型子痫前期(lo PE)的胎盘组织中SIRT3蛋白的表达及定位。并应用瞬时转染使HTR-8/SVneo细胞过表达SIRT3,然后检测滋养细胞的细胞增殖、细胞周期、侵袭和迁移能力的变化。此外,通过Co Cl2构建滋养细胞氧化应激模型,研究SIRT3对HTR-8/SVneo细胞抗氧化应激能力的调控。最后,应用Western blotting检测AKT信号通路关键蛋白表达,探讨SIRT3调控滋养细胞生物学功能,进而参与子痫前期发病的机制。结果:妊娠各阶段胎盘组织中均有SIRT3蛋白表达,主要定位于细胞滋养细胞、合体滋养细胞以及间质绒毛外滋养细胞。与早、中孕期正常胎盘组织相比,SIRT3的表达水平在晚孕期胎盘组织中明显降低;且eo PE和lo PE患者胎盘组织中SIRT3的表达较相应对照组显著降低。上调滋养细胞SIRT3的表达,可以增强HTR-8/SVneo细胞的增殖能力,将滋养细胞阻滞在G1期,并将其转换为侵袭表型。另外,HTR-8/SVneo细胞中SIRT3表达增加可以显著缓解Co Cl2诱导的滋养细胞氧化应激。而且,过表达SIRT3同时也使AKT信号通路上的关键蛋白表达显著上调。结论:本研究证明了SIRT3在人正常妊娠和子痫前期胎盘组织中的表达及其对滋养细胞功能的影响。研究发现SIRT3显著增强HTR-8/SVneo细胞的增殖、迁移和侵袭能力,还能明显缓解Co Cl2诱导的滋养细胞氧化应激。这些发现提示SIRT3通过AKT信号通路在调节子宫螺旋动脉重铸以及胎盘氧化应激过程中发挥了重要作用。为寻找PE的药物治疗靶点以及其病因学提供新思路。

关键词： 椎间盘退变   髓核间充质干细胞   胎牛血清   生物学活性  

摘要： 研究背景:颈腰痛是由椎间盘退变引起的一系列临床症状,是临床上常见的疾病之一,并且可以导致患者长期伤残影响患者的日常生活,增加了个人和社会医疗成本。椎间盘的结构特殊,周围环境呈高渗和低PH的状态,而且由于没有血管直接供应导致其营养和氧气供应远低于其他组织。随着椎间盘退变程度的增加,椎间盘内细胞微环境会发生变化,软骨终板出现钙化损害代谢途径,营养供应进一步减少,这些改变会进一步加重椎间盘退变,形成恶性循环。导致椎间盘退变的确切机制还没有被完全阐明。有研究显示椎间盘退变的关键因素是髓核细胞的数量和质量的下降。所以,现阶段针对椎间盘退变的治疗方向主要集中在增加并恢复髓核细胞的数量和质量。有研究表明人髓核之中含有髓核间充质干细胞(nucleus pulposus mesenchymal stem cells,NPMSCs),具有多向分化功能并可自我更新,使它们成为椎间盘退变中细胞治疗的潜在候选细胞。通过刺激内源性NP-MSCs的再生和修复能为椎间盘退变的治疗带来了新途径。但是由于椎间盘低营养的微环境给髓核间充质干细胞的再生和修复增加了困难。因此探索椎间盘内营养供应变化对髓核间充质干细胞的生物学活性的影响尤为重要。研究目的:本研究拟在体外观察不同血清浓度对人正常髓核间充质干细胞生物学活性的影响,初步探讨椎间盘内营养供应的变化参与的椎间盘退变的机制。研究方法:选取先天性脊柱侧凸矫形患者的髓核组织(Pfirrmann分级为Ⅰ级或Ⅱ级),体外分离培养NPMSCs。首先,利用流式细胞仪分别对细胞的表型进行检测(CD105、CD90、CD73、CD45、CD34和人类白细胞抗原(HLA)-DR)。再观察其向成骨、成脂和成软骨诱导分化能力。之后,取P3代NPMSCs在含有0%、5%和10%体积浓度胎牛血清的培养液中进行培养,分别对其细胞增殖能力、细胞周期、细胞凋亡率以及OCT4(octamer-binding transcription factor 4 OCT4)、Nanog、Jag1、Notch1干性基因和I型胶原(Collagen I)、II型胶原(Collagen II)、蛋白多糖(Aggrecan)和SOX9(SRY related HMG box-9)表达情况进行检测。研究结果:从正常髓核组织中分离培养的细胞可以呈纺锤状、贴壁生长,可体外扩增,流式细胞仪检测结果显示高表达CD73(98.9%)、CD90(97.9%)、CD105(98.9%),低表达HLA-DR(3.11%)、CD34(1.83%)、CD45(1.19%),且可以向成骨细胞、脂肪细胞及类软骨细胞分化。根据国际干细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy ISCT)评定标准,分离培养的细胞为NPMSCs。随着血清浓度的降低,细胞增殖率显著下降,凋亡率增加,而且可以显著延长G1期时长(P<0.05)。QRT-PCR结果显示:随着血清浓度的下降,干性基因(OCT4、Nanog、Jag1、Notch1)的相对表达量明显减少,I型胶原相对表达水平增加,II型胶原、蛋白多糖和SOX9的相对表达水平减少(P<0.05)。研究结论:血清浓度对人NPMSCs的生物学活性具有重要影响。血清浓度的降低,可显著抑制NPMSCs细胞增殖、干性基因及相关功能基因的表达。本研究不仅为椎间盘退变过程中NPMSCs保持“静默”提供理论基础,同时为其生物学治疗提供新思路。