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关键词： 胶质瘤   生物信息学   BCAT1   CDC6   富集分析   shRNA  

摘要： 背景和目的:胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤,约占中枢神经系统肿瘤的30%,所有中枢神经系统恶性肿瘤的80%。外科手术很难完全切除胶质瘤,且该肿瘤易复发,耐药性和抗辐射性强,患者总体生存期短,因此它对人类健康构成较大的威胁。虽然近些年来很多新兴治疗手段显示出一定成效,外科手术切除方式和放化疗技术也具有一些革新,但胶质瘤的整体预后效果仍然不乐观。随着分子生物学、细胞生物学、遗传学等科学研究和医学检测技术的不断深入,分子标记物已成为近年来肿瘤疾病领域研究的热点。研究胶质瘤的病理分子生物学特征从而找出明确的发病相关基因,对探索有效的早期诊断和预后评价指标、提供有效的个性化治疗方式、提升病患的存活率都具有极其重要的临床意义。生物信息学作为许多生物学领域研究的重要组成,其主要研究内容是利用相关的软件工具和生物算法对生物数据进行采集、处理、存储、分析和解释。它能够让我们更好地挖掘生物遗传中的信息,更好地理解某些基因和蛋白质表达在肿瘤发生发展过程中的调节作用。研究发现支链氨基酸转移酶1(BCAT1)和细胞分裂周期蛋白6(CDC6)在多种恶性肿瘤中异常表达提示其能够促进肿瘤细胞增殖、侵袭及转移,它们或许是相关恶性肿瘤潜在的生物分子标记物或者治疗靶点。但目前国内外仍然缺乏BCAT1和CDC6与胶质瘤相关的研究。本文旨在以CGGA数据库中胶质瘤基因表达谱数据为研究对象通过生物信息学的方法探讨胶质瘤组织中BCAT1和CDC6在m RNA水平上的表达情况,与患者临床特征及预后的相关性以及BCAT1和CDC6作用的信号通路,免疫组化的方法研究胶质瘤组织中BCAT1和CDC6在蛋白水平上的表达情况并探究BCAT1和CDC6对胶质瘤细胞生物学特性的影响。方法:1.基于R 3.6.1软件对CGGA数据库内胶质瘤相关m RNA表达量和Clinical数据进行差异分析,初步筛选出在胶质瘤中呈差异性表达的目标基因。2.以CGGA数据库内BCAT1和CDC6在胶质瘤组织内的表达量中位值为标准,分别将纳入病例分为高、低表达组,采用Kaplan-Meier生存分析探讨BCAT1和CDC6表达量对胶质瘤患者生存的影响。COX单因素及多因素回归分析BCAT1、CDC6、性别、年龄、病理类型、病理分级、复发状态、放疗、化疗、IDH突变状态、染色体1p/19q联合缺失状态等得出独立预后因子。运用ROC曲线研究预后相关的预测因素。通过Wilcoxon检验和Kruskal-Wallis检验分析BCAT1和CDC6表达量与临床特征的相关性。3.根据CGGA数据库的胶质瘤患者中BCAT1和CDC6的m RNA表达量的中位值作为基准,分别将纳入的病例分为高、低表达组。从分子特征数据库下载参考集***[Gene ontology],设置随机模拟计算的数量为1000,统计学P值(NOM P)<0.05,错误发现率(FDR)<0.25。使用GSEA4.0软件进行基因富集分析。根据富集分析结果,探讨BCAT1和CDC6高表达状态所激活的信号通路对胶质瘤生物学功能的影响,进而更深层次理解BCAT1和CDC6差异性表达对胶质瘤预后的影响机制。4.纳入92例2014年1月至2016年12月于四川大学华西医院病理确诊为高级别胶质瘤的病例,免疫组化法检测这些患者BCAT1和CDC6的表达情况。采用Kaplan-Meier法对患者BCAT1表达、CDC6表达以及其他6个因素进行生存分析,Spearman检验分析BCAT1和CDC6在胶质瘤组织中的表达相关性,采用COX回归比例风险模型进行患者生存的单因素和多因素分析,卡方检验分析BCAT1和CDC6表达与临床因素的相关性,采用ROC曲线分析患者预后相关的预测因素。5.通过CCK-8处理BCAT1和CDC6下调后的胶质瘤细胞以及经过替莫唑胺处理48h后的胶质瘤细胞并测定各孔在450nm波长处的吸光度值探究U87细胞和U251细胞分别经BCAT1和CDC6下调后细胞增殖和化疗抵抗能力的变化。6.通过Transwell模型和Matrigel基质胶并在显微镜下对迁移细胞和侵袭细胞的计数探究U87细胞和U251细胞分别经BCAT1和CDC6下调后迁移侵袭能力的变化。7.通过流式细胞仪检测U87细胞和U251细胞分别经BCAT1和CDC6下调后在细胞凋亡和细胞周期的变化。结果:1.经过生存分析过滤、COX多因素分析过滤以及ROC曲线过滤这三层过滤后筛选出包括BCAT1和CDC6在内的131个基因可以作为在胶质瘤中呈差异性表达的目标基因。2.生存分析提示BCAT1和CDC6低表达组生存情况显著优于高表达组,该两组具有显著统计学差异(P<0.001)。其中BCAT1高低表达组的五年生存率分别为19.6%和58.9%,CDC6高

关键词： 医学细胞生物学   SPOC   混合教学  

摘要： 医学细胞生物学是一门重要的医学专业基础课程,是医学生重要的知识构成。为适应目前高素质医学人才培养的要求,创新医学细胞生物学课程的教学手段、优化教学过程和提高教学质量已迫在眉睫。探索SPOC混合教学模式在医学细胞生物学课程中的建设、开展形式、合理应用及教学效果,旨在将传统的教学模式向网络化、交互化、深层化、多样化的教学模式推进,构建一种更加开放、灵活、高效的教学方法。

关键词： 医学   细胞生物学   医学院校   教材  

ISBN: (纸本)9787306071217

摘要： 本书按照模块化教学原则，将细胞生物学、细胞工程学及组织工程学中与医学密切相关的内容进行有机整合。全书内容主要包括细胞的基本结构、功能、生命活动，细胞工程的基本技术及细胞工程在医学上的应用，以及组织工程的研究进展及临床应用。

关键词： 瘢痕疙瘩   成纤维细胞   miR-409-3p  

摘要： 目的:研究miR-409-3p在人瘢痕疙瘩组织和人瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达情况及其对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡、侵袭/迁徙能力和细胞周期的影响。方法:(1)采用实时荧光定量PCR检测miR-409-3p在人瘢痕疙瘩组织及人瘢痕疙瘩成纤维细胞与人正常皮肤组织及人正常皮肤成纤维细胞中的表达量。(2)体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞,分为miR-409-3p mimic组和miR-409-3p NC组并用相应的脂质体进行转染。(3)用EdU法检测细胞增殖能力;划痕实验和Transwell小室法检测细胞侵袭/迁移能力;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果:(1)实时荧光定量PCR结果显示8例人瘢痕疙瘩组织中miR-409-3p的表达量与8例人正常皮肤组织相比明显下降(P<0.01);5例人瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-409-3p的表达量与5例人正常皮肤成纤维细胞相比明显下降(P<0.01)。(2)转染相应脂质体后,实时荧光定量PCR 结果显示 miR-409-3p mimic 组 miR-409-3p 的表达量较 miR-409-3p NC 组显著上调(P<0.001)。(3)与 miR-409-3p NC 组相比,miR-409-3p mimic组细胞增殖能力显著下降(P<0.05);侵袭/迁徙能力明显下降(P均<0.001);细胞凋亡比例增加(P<0.001);G1期细胞比例明显增多(P<0.01),S期细胞比例显著减少(P<0.001)。结论:miR-409-3p在人瘢痕疙瘩组织和人瘢痕疙瘩成纤维细胞中低表达,且上调miR-409-3p在人瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达能够明显抑制细胞的增殖、侵袭/迁移能力,并且能够上调G1期、下调S期细胞比例并诱导细胞凋亡。提示miR-409-3p可能通过影响人瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学功能从而抑制瘢痕疙瘩的发生、发展。

摘要： 为全面提升医学课程教学质量,需要充分发挥信息技术的教学支持与辅助优势,通过建设基础医学"金课",完善和优化基础医学课程的实践机制,全面提升基础医学教学质量。本文将结合《医学细胞生物学》一书,分析当前信息技术与基础医学科课程建设的融合问题,探索深度融合信息技术的基础医学"金课"建设模式及实践路径,以期为当前全面提升基础医学课程质量提供有效动力。

关键词： 三阴性乳腺癌   乳腺癌干细胞   干性   临床病理因素   预后   HES1   Slug  

摘要： 目的:乳腺癌是中国女性最常见的恶性肿瘤,是女性肿瘤相关死亡的主要原因。三阴性乳腺癌(ER-,PR-,Her2-,Triple negative breast cancer,TNBC)因其缺乏有效针对性的治疗靶点,是预后相对最差的乳腺癌亚型。三阴性乳腺癌因其富含乳腺癌干细胞(又名乳腺肿瘤干细胞,Breast Cancer Stem Cells,BCSCs)是高度异质性的肿瘤。乳腺肿瘤干细胞是具有自我更新特性,不断增殖以及多向分化潜能的一类数量很少的细胞亚群,也被认为是乳腺癌起源,恶性进程,治疗抵抗和早期复发转移的根源。由于目前对三阴性乳腺癌干细胞的调控机制尚未清晰阐明,揭示三阴性乳腺癌特异性的干性调控因子及机制的研究具有重要的理论和临床指导意义。HES1是碱性螺旋-环-螺旋(basic helix loop helix,b HLH)类转录因子,参与许多生物学发展进程,尤其是维持干细胞未分化状态。HES1是双向转录因子,参与许多肿瘤的恶性转化,也是许多干性相关的信号通路的下游靶效应分子。在恶性肿瘤中,HES1很可能发挥调控自我更新的干细胞特性的重要作用。已发表的前期研究证实,HES1在乳腺癌中呈高表达,预示不良预后,与三阴性分型密切相关;HES1能够导致上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT),增强乳腺癌细胞迁移及侵袭能力。目前尚未见HES1在三阴性乳腺癌中的生物学属性及其对三阴性乳腺癌干细胞生物学特性调控作用的相关报道。本研究通过明确HES1对EMT驱动因子Slug的调控以及HES1/Slug轴与三阴性乳腺癌的临床相关性;阐明HES1/Slug轴在三阴性乳腺癌中调控干性的生物学功能和机制以及导致EMT,促进侵袭的功能,有望发现三阴性乳腺癌中特异性的干性调控因子及机制,为找到新的预后标志物和特异性肿瘤干细胞的个体化治疗靶点提供理论依据。研究方法:1、三阴性乳腺癌临床样本中HES1和Slug的生物学属性:在150例三阴性乳腺癌临床组织样本中,利用免疫组化检测HES1的表达情况,分析与临床病理学指标的相关性和与生存预后的相关性。在三阴性乳腺癌细胞系中,利用Western blot和RT-PCR,探究和明确HES1调控的EMT驱动因子Slug,并在150例三阴性乳腺癌临床组织样本中,利用免疫组化检测Slug的表达情况,分析Slug与临床病理学指标的相关性和利用Kaplan-Meier生存分析评估Slug与生存预后的相关性,以及利用皮尔森相关性分析评估HES1与Slug表达的相关性。2、HES1调控Slug表达的分子机制实验:利用生物信息学分析预测到Slug启动子区存在HES1潜在结合位点。利用染色质免疫共沉淀实验(Chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)验证HES1与Slug启动子区潜在位点序列的结合关系。利用荧光素酶双报告基因实验验证HES1对Slug启动子区转录活性的调控。3、HES1通过上调Slug,促进三阴性乳腺癌干性获得的体外细胞学实验:构建稳定敲低HES1和敲低HES1后过表达Slug以及阴性对照的三阴性乳腺癌细胞系模型;通过Western blot检测SOX2,OCT4,Nanog等干性标记物的表达变化;通过干细胞球囊形成实验和克隆形成实验分别检测乳腺癌干细胞的自我更新能力和乳腺癌细胞的增殖能力的改变;通过流式细胞术检测经干细胞球囊形成实验所形成的干性球囊细胞中干性表型细胞(CD44CD24)亚群比例的变化。4、HES1通过上调EMT驱动因子Slug,促进三阴性乳腺癌细胞迁移侵袭能力的体外细胞学实验:构建稳定敲低HES1和敲低HES1后过表达Slug以及阴性对照的三阴性乳腺癌细胞系模型;通过Western blot检测E-cadherin和N-cadherin的表达变化;通过Transwell实验检测癌细胞的迁移和侵袭能力的改变。5、HES1/Slug轴调控三阴性乳腺癌干细胞特性的体内实验:利用荷瘤鼠移植瘤实验体内验证HES1通过上调Slug对三阴性乳腺癌干性的调控。结果:1、HES1和Slug是三阴性乳腺癌的促癌预后因子:在150例临床三阴性乳腺癌组织样本中,HES1高表达与肿物大小(p=0.0262),淋巴结转移(p=0.0129)和高TNM分期(p=0.0001)显著正相关,且预示不良预后。在三阴性乳腺癌细胞系中,HES1能够特异性的上调EMT驱动因子Slug表达。在150例临床三阴性乳腺癌组织样本中,Slug高表达与肿物大小(p=0.0092),淋巴结转移(p=0.0060)和高TNM分期(p=0.0005)明显正相关,且预示不良预后。HES1与Slug表达呈显著的正相关性。HES1对三阴性乳腺癌生存预后的影响可能很大程度

关键词： 宫颈癌   KPNA2   细胞增殖   生物学功能  

摘要： 物质的核运输在细胞的生物功能中起重要作用，对于离子和小分子物质可通过被动转运自由的穿过核孔;但是对于大分子物质(质量大于40KD)进出细胞核则需与核转运因子相结合，并通过主动转运才能实现，而karyopherin蛋白家族在这一过程中是不可缺少的。KPNA2是karyopherin-α家族中较为重要的一员，许多研究已经证实KPNA2通过参与物质的核运输与细胞的生命活动密不可分，与多种癌症的增殖、转移和侵袭等有关，但是KPNA2在宫颈癌中作用还未明确，本篇论文主要是探索KPNA2在宫颈癌组织及宫颈癌细胞系中所起到的作用及其部分机制。　　本文的研究主要分为以下五个方面：(1)KPNA2mRNA在肿瘤中的表达情况，并进一步分析了在宫颈癌中KPNA2mRNA的突变类型和临床病理学参数的关系;通过临床标本进一步验证了KPNA2蛋白在宫颈癌中的表达及临床病理学参数的关系。(2)体外实验探索了KPNA2蛋白在宫颈癌细胞系中的作用，探讨其对宫颈癌细胞相关生物学行为的影响。(3)体内实验探索了KPNA2蛋白对宫颈癌细胞增殖能力的影响。(4)探索了KPNA2是通过哪些机制影响了宫颈癌细胞的生物学行为。(5)探索了KPNA2是否参与了JMJD3是细胞亚定位。　　方法：　　通过分析GEO、TCGA和GTEx数据库分析了KPNA2mRNA在宫颈癌中的表达与突变情况，及其与临床分期和整体生存期的关系。并通过免疫组化分析KPNA2蛋白在宫颈癌中的表达，通过卡方检验分析了KPNA2蛋白与临床病理学参数的关系。(2)通过Westernblot及RT-qPCR检测了人永生化角质形成细胞HaCaT和宫颈癌细胞系HeLa、CaSki、SiHa、C33A中KPNA2蛋白和mRNA的表达;选择KPNA2高表达的宫颈癌细胞系SiHa和C33A进行干扰，通过质粒转染，最终筛选效果最明显的质粒，根据其干扰序列进行慢病毒构建，将慢病毒进行细胞内转染，最终得到KPNA2稳定干扰的宫颈癌细胞株C33A-LV3-1101和SiHa-LV3-1101及其对照组C33A-LV3-NC和SiHa-LV3-NC。通过CCK8和细胞克隆实验证实KPNA2蛋白对宫颈癌细胞增殖能力的影响。通过细胞划痕实验和Transwell实验证实了KPNA2蛋白对宫颈癌细胞迁移能力和侵袭能力的影响。通过流式细胞术检测了细胞周期的变化，证实了KPNA2对细胞周期的影响;通过凋亡试剂盒检测了KPNA2对宫颈癌细胞凋亡的影响;通过Westernblot检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Twist1蛋白的表达可以反映出KPNA2对宫颈癌细胞系上皮间质转化的影响;通过Westernblot检测CD133、Osteopontin和Nanog蛋白的表达可以反应出KPNA2蛋白对干细胞表型的影响。(3)将C33A-LV3-NC和C33A-LV3-1101接种于免疫缺陷的裸鼠皮下，构建人宫颈癌细胞的移植瘤模型，在体内水平研究干扰KPNA2后对宫颈癌生物学行为的影响。通过对比实验组和对照组中裸鼠宫颈癌移植瘤体积和质量，探讨干扰KPNA2表达后对宫颈癌移植瘤的生长的影响。(4)通过Westernblot检测MAPK/ERK和PI3K/AKT细胞通路的主要蛋白，探讨干扰KPNA2后对细胞通路MAPK/ERK和PI3K/AKT的影响;给予激动剂LM22B-10后，通过Westernblot检测MAPK/ERK和PI3K/AKT细胞通路的变化，并通过CCK8和Transwell实验验证激动剂LM22B-10对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。(5)通过Westernblot实验探讨干扰KPNA2蛋白的表达对JMJD3总蛋白和JMJD3的细胞内亚定位的影响;通过cNLSMapper网站预测JMJD3的NLS部位;通过Westernblot检测H3K27me3的表达水平，验证当KPNA2下调时，通过调节JMJD3蛋白细胞亚定位影响了H3K27me3的表达。　　结果：　　(1)KPNA2mRNA在多数癌症中高表达，且在宫颈癌组织中的表达明显高于正常宫颈组织;KPNA2mRNA和蛋白的表达水平与宫颈的临床分期呈显著正相关;KPNA2蛋白高表达，与宫颈癌组织学分级呈正相关。　　(2)在宫颈癌细胞系中KPNA2高表达;KPNA2可以促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和迁徙;干扰KPNA2表达后宫颈癌细胞出现了G2/M期阻滞，并且细胞凋亡比例明显升高;KPNA2干扰后宫颈癌细胞的上皮性特征增强，并影响了宫颈癌干细细胞标记物的表达。　　(3)干扰KPNA2后可以有效的抑制裸鼠体内宫颈癌移植瘤的生长;干扰KPNA2后，裸鼠宫颈癌移植瘤细胞形态为类圆形，细胞间界限明显，细胞核染色质清晰。　　(4)干扰KPNA2表达可以抑制MAPK/ERK

关键词： 翻转课堂   生命科学   教学改革  

摘要： 近年来,由于信息科技的迅猛发展,多媒体技术已经广泛地应用于我国科学及经济建设的各个领域。其中细胞生物学在教学过程中,更是采用了多种数字化教学模式。根据目前的教学成果调查显示,在高校课堂上采取翻转课堂的教学模式,对于拓展大学生的科学视角、丰富大学课堂的教学内容、提升大学生对专业知识的学习兴趣以及对科学领域的探索和创新都有着不容忽视的促进作用。以全新的教育理念,从不同角度分析了翻转课堂在细胞生物学教学中的重要作用,并且针对在当前教学过程中存在的一些问题,提出相应的改进办法。希望在未来的高校课堂上,能够真正实现以学生为主导地位的教学模式,以提升高校的教学效果。

关键词： 食管癌   5-氮-2-脱氧胞苷   丁酸钠   细胞增殖   SOX1基因  

摘要： 背景食管癌是常见的恶性肿瘤,高发地区发病率约为0.05%,其中食管鳞状细胞癌占90%。性别决定区Y框蛋白1（Sex determining region Y-box 1,SOX1）属于高迁移率族蛋白DNA结构域转录因子,在多种肿瘤中的表达受到抑制。已有研究表明,SOX1基因在食管鳞癌组织中的表达显著降低,与肿瘤浸润深度、进展分期和淋巴结转移数目等预后不良指标显著相关;且其启动子区域的Cp G位点呈现高甲基化状态。近年来甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的联合应用成为肿瘤生物学治疗的研究热点。因此,本论文拟采用甲基转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠（NaBu）联合应用研究其对食管癌细胞系增殖、凋亡等的作用及对SOX1表达的影响。结果为深入研究SOX1基因表达调控在食管癌发生发展中的分子机制,寻找特异的食管癌肿瘤生物标志物奠定实验和理论基础。目的1.甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR和组蛋白去乙酰化酶抑制剂NaBu联合处理对食管癌细胞Eca109和EC9706增殖、凋亡及细胞周期等细胞生物学特性的影响;2.5-Aza-CdR和NaBu联合处理对食管癌细胞Eca109和EC9706中SOX1基因表达的影响。方法1.5-Aza-CdR和NaBu对食管癌细胞增殖的影响。实验采用两种食管癌细胞株Eca109和EC9706,设为八个实验组:三个5-Aza-CdR浓度组（2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）,三个NaBu浓度组（l.0 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L）,联合用药组（10μmol/L 5-Aza-CdR+2.5mmol/L NaBu）,以及对照组。各实验组食管癌细胞加药处理后正常培养48 h,MTT法检测5-Aza-CdR和NaBu单用、联合应用对肿瘤细胞增殖的抑制率。2.5-Aza-CdR和NaBu对食管癌细胞凋亡及周期的影响。实验分组如下:10μmol/L5-Aza-CdR组、2.5 mmol/L NaBu组、10μmol/L 5-Aza-CdR+2.5 mmol/L NaBu、食管癌细胞对照组。各实验组食管癌细胞加药处理后正常培养48 h,应用Annexin V/PI双染色法和流式细胞分析法,检测分析5-Aza-CdR和NaBu单用、联合应用对Eca109和EC9706细胞凋亡率及周期分布影响。3.5-Aza-CdR和NaBu对食管癌细胞SOX1基因的表达影响。收集上述2的各实验组食管癌细胞,分别提取总RNA反转录为c DNA并进行实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,qRT-PCR）检测,采用2-△△Ct法分析SOX1基因m RNA相对表达水平;分别提取各实验组食管癌细胞的总蛋白质进行Western blot实验,检测分析SOX1的蛋白表达变化。结果***检测结果显示:5-Aza-CdR和NaBu处理后,食管癌细胞株EC9706和Eca109的生长明显受到抑制,其作用具有时间和剂量依赖性。在相同的时间点及药物剂量条件下,两种药物联合应用组对食管癌细胞的抑制率相对于单一用药组更明显（P<0.05）。2.流式细胞术检测表明:相对于空白对照组,5-Aza-CdR和NaBu作用细胞48 h后,EC9706和Eca109两种食管癌细胞凋亡率明显升高（P<0.05）;联合用药组凋亡率明显强于单用药组（P<0.05）。细胞周期分析结果表明,处于对数生长期的对照组食管癌细胞株主要分布于G0/G1期和S期,G2/M期相对较低。单独用NaBu处理细胞48 h后,G0/G1期细胞明显增加;大部分细胞阻滞在G0/G1期;单独应用5-Aza-CdR处理细胞48 h后,处于S期的细胞明显增多,细胞周期多数阻滞在S期;联合用药组G0/G1期阻滞相对于对照组最为显著（P<0.05）。***-PCR结果显示,与对照组细胞相比,单独用5-Aza-CdR或联合用药组作用EC9706和Eca109细胞48 h后SOX1的m RNA表达增加（P<0.05）。Western Blot结果表明5-Aza-CdR或联合用药组促进了SOX1蛋白的表达。结论1.5-Aza-CdR和NaBu及二者的联合应用均能显著抑制人食管癌细胞的增殖,其抑制作用可能与阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡有关。2.5-Aza-CdR及其与NaBu的联合应用可上调食管癌细胞SOX1基因m RNA和蛋白的表达。

关键词： 冠心病   动脉粥样硬化   内皮细胞损伤   炎性因子   外泌体   microRNA  

摘要： 冠心病(coronary artery disease,CAD)是人类死亡的主要原因之一,稳定性冠心病(stable CAD,SCAD)是其最常见的类型。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是CAD的病理基础,其主要的起始因素是内皮功能障碍。外泌体是由细胞分泌的纳米级囊泡,包含RNA和蛋白质等生物活性分子,广泛参与机体的病理生理过程。研究表明循环外泌体中内容物尤其是miRNAs的表达异常与CAD、脑梗死等AS引起的心脑血管疾病密切相关。但有关血清外泌体及其内容物在AS发生发展中的作用和机制却鲜有报道。本课题主要探究SCAD血清外泌体及其差异miRNA对内皮细胞增殖、迁移、成管和炎症反应等生物学功能的影响及其潜在机制。为了探讨SCAD血清外泌体是否影响内皮细胞生物学功能,我们采用ExoQuick试剂盒提取SCAD组和对照组的血清外泌体,将两组血清外泌体分别与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共培养。激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分析显示HUVECs对两组血清外泌体的摄取能力无差异,CCK-8、划痕和Transwell实验、小管形成实验和qPCR结果分别显示SCAD血清外泌体能够显著降低细胞增殖活力、迁移和成管能力并上调炎性因子IL-1β、TNF-α和ICAM-1的表达,表明SCAD血清外泌体能够诱发内皮细胞损伤和炎症反应。为了发现SCAD血清外泌体中表达异常的miRNAs并探讨其是否参与调控内皮细胞生物学功能,我们采用高通量测序分析SCAD组和对照组的血清外泌体miRNAs表达谱,从中选取表达水平较高且变化2倍以上的 miRNAs 进行 qPCR 验证。qPCR 结果显示 miR-942-5p、miR-149-5p 和 miR-32-5p水平在SCAD血清外泌体中显著升高,且生物信息学分析表明这些miRNAs参与调控内皮细胞生物学功能。值得注意的是,miR-32-5p已被报道与CAD中内皮细胞损伤和炎症反应相关,但其具体作用和机制尚不清楚。为了进一步探讨miR-32-5p在内皮细胞损伤和炎症反应的作用和机制,我们采用氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)处理 HUVECs 诱导内皮细胞损伤和炎症反应;利用TargetScan软件预测miR-32-5p与AIDA 3'UTR的结合位点,并用双荧光素酶报告基因验证两者的靶向关系。我们发现:在oxLDL诱导的HUVECs中,miR-32-5p表达降低而AIDA表达升高,且miR-32-5p能够靶向抑制AIDA的表达;过表达miR-32-5p或敲低AIDA均能显著提高oxLDL诱导的HUVECs细胞增殖活力、迁移和成管能力,并抑制炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1的表达和NF-κB通路。这些结果表明miR-32-5p可能通过调控AIDA/NF-κB通路减轻oxLDL诱导的内皮细胞损伤和炎症反应。综上所述,SCAD血清外泌体及其差异miR-32-5p对内皮细胞生物学功能具有重要调控作用;SCAD血清外泌体能够诱发内皮细胞损伤和炎症反应,其差异miR-32-5p可能在该过程中起抑制作用。本课题对血清外泌体及其内容物在AS的病理生理过程中的潜在作用提出了新见解,且有助于为SCAD提供新的诊断标志物和治疗靶点。