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关键词： CD320   TCN2   维生素B12   极性上皮细胞   顶端膜表达   蛋白酶   脱落  

摘要： 第一章:CD320和TCN2在肠和肾脏组织的表达分布研究研究目的:CD320是一个细胞膜表面受体,参与维生素B12向细胞内的转运。血浆中的维生素B12与钴胺传递蛋白2（Transcobalamin Ⅱ,TCN2）的复合物与CD320结合,经过胞吞作用将维生素B12释放到组织细胞中发挥作用。一直认为,CD320的主要功能是介导维生素B12从血液至组织细胞中的转运,而不参与维生素B12在肠道的吸收,以及肾脏中的重吸收。但也有研究提示,CD320在肠和肾脏组织中有表达。目前,CD320在肠道以及肾脏各段的表达分布尚不清楚。另外,CD320在肠道和肾脏组织中表达的细胞类型也未阐明。本章旨在探究CD320与其配体TCN2在小肠、大肠和肾脏的各段分布情况,以及具体表达的细胞类型。这对了解CD320参与维生素B12的代谢功能有生理意义。研究方法:1.通过反转录酶-聚合酶链锁反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）方法检测CD320和TCN2 mRNA在小鼠十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠和肾脏的表达情况。2.通过苏木素＆伊红染色（Hematoxylin＆eosin staining,H＆E）和免疫组化实验检测CD320和TCN2蛋白在小鼠小肠（十二指肠、空肠和回肠）的表达位置以及细胞类型。3.通过H＆E染色和免疫组化实验检测CD320和TCN2蛋白在小鼠大肠（盲肠、结肠和直肠）的表达位置以及细胞类型。4.通过免疫组化实验确定CD320和TCN2蛋白在小鼠和人肾脏组织中肾小球和肾小管各段的表达情况,并通过组织免疫荧光实验确定CD320和TCN2蛋白在小鼠和人肾小管中的细胞定位。研究结果:***-PCR结果显示,CD320和TCN2 mRNA在小鼠的十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠和肾脏中均有表达,而且TCN2mRNA在肾脏组织中的表达量高于肠组织中的表达。2.免疫组化结果显示,CD320和TCN2蛋白主要表达在小鼠的十二指肠、空肠和回肠的上皮吸收细胞,少量表达在内分泌细胞,而在杯状细胞和潘氏细胞中基本不表达。3.免疫组化结果显示,CD320和TCN2蛋白在小鼠的盲肠、结肠和直肠的上皮吸收细胞也有表达,而在杯状细胞中则基本不表达。4.免疫组化和免疫荧光结果显示,CD320蛋白主要表达在肾脏的近端小管和集合管,而在肾小球和远端小管基本不表达;TCN2蛋白在肾小球、近端小管、远端小管和集合管中均有表达。5.免疫荧光结果显示,CD320表达在肾小管上皮细胞的刷状缘即细胞顶端膜;TCN2蛋白在肾小管上皮细胞呈弥漫型胞内分布。结论:CD320和TCN2蛋白在小肠和大肠的上皮吸收细胞以及肾小管上皮吸收细胞均有表达。在肾小管上皮吸收细胞,CD320呈特异性顶端膜表达。这些结果提示,CD320可能参与了维生素B12在肠道的吸收以及肾小管中的重吸收过程。第二章:CD320在极性上皮细胞顶端膜特异性表达的分子机制研究研究目的:在第一章中,我们发现CD320蛋白特异性表达在肾小管上皮细胞的顶端膜。但是CD320特异性顶端膜表达的机制尚不清楚。另外,我们还发现CD320蛋白也表达在肠极性上皮细胞中。但是,CD320在肠上皮细胞中是否同样存在特异性顶端膜表达的现象还不清楚。如果存在的话,CD320蛋白在肠上皮吸收细胞中特异性顶端膜表达的机制是否和肾小管上皮细胞中特异性顶端膜表达机制相同?因此,本章旨在探究CD320蛋白在肾小管上皮细胞和肠上皮细胞中特异性顶端膜表达的分选机制。研究方法:1.利用犬肾小管上皮（Madin-Darby Canine Kindey,MDCK）细胞为极性膜蛋白表达模型。将CD320表达质粒转染进MDCK细胞,通过共聚焦显微镜免疫荧光的实验方法检测CD320蛋白在MDCK细胞中是否存在特异性顶端膜表达的现象。2.构建CD320各结构域突变体质粒,包括ΔC-CD320（胞质段缺失）,R1-CD320（用 LDLR1（Low-Density Lipoprotein Receptor,LDLR）结构域代替 LDLR2结构域）,R2-CD320（用LDLR2结构域代替LDLR1结构域）。将野生型CD320及其突变体质粒转染进MDCK细胞,通过共聚焦显微镜免疫荧光技术探究CD320的各结构域对CD320在MDCK细胞中特异性顶端膜表达的影响。3.将CD320蛋白LDLR2结构域上的“DSSDE”氨基酸序列突变成“AAAAA”序列,检测“AAAAA”突变体在MDCK细胞中是否依然存在特异性顶端膜表达。4.将CD320和上述构建的CD320突变体转染进人肠Caco-2细胞（Human colorectal adenocarcinoma cells,Caco-2）,通过共聚焦

关键词： 子宫内膜癌   肿瘤干细胞   RNA结合蛋白   UPF1   长链非编码RNA   PVT1   miR-508-5p  

摘要： 目的:子宫内膜癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一,近年来发病率呈上升趋势,严重威胁女性健康。子宫内膜癌的治疗手段包括手术治疗,放化疗以及激素治疗等。大多数子宫内膜癌患者在诊断时处于疾病早期且预后良好,但仍有20%的中晚期患者在治疗后出现转移和复发。子宫内膜癌干细胞(Endometrial cancer stem cells,ECSCs)是子宫内膜癌细胞中数目较少但具有自我更新能力和多向分化潜能的一群细胞,在子宫内膜癌发生、发展、转移与复发中起到重要作用,可能是导致子宫内膜癌治疗失败的原因,因此深入探索ECSCs生物学特征的相关机制具有重要的理论意义和临床价值。上游移码突变体1(Up-frameshift mutant 1,UPF1)是无义介导的m RNA降解途径的核心蛋白,与肿瘤的发生发展密切相关。研究表明,UPF1能够促进神经干细胞增殖,维持神经干细胞的干性,并作为分子开关决定神经元前体细胞是否分化。UPF1也可作为RNA结合蛋白而发挥作用,参与到转录后水平的基因表达调控中去。RNA结合蛋白参与调节RNA的稳定性、可变剪接、转运和翻译,通过结合RNA形成RNA-蛋白复合物从而调控包括肿瘤在内的许多疾病的发生和发展。长链非编码RNA(Long non-codingRNAs,lncRNAs)是一类长度超过200个核苷酸,没有蛋白质编码能力的RNA。LncRNAs不仅在细胞增殖、侵袭、分化和干性维持中发挥重要的调节作用,还通过表观遗传修饰、转录和转录后水平调控等方式参与肿瘤的发生发展。人浆细胞瘤变体异位基因1(Plasmacytoma variant translocation 1,PVT1)定位于人类染色体8q24,已被证实在ECSCs中显著高表达,促进ECSCs恶性生物学行为。PVT1可以作为分子海绵竞争性结合miRNA,拮抗miRNA抑制靶基因的功能,进而影响肿瘤发生发展。本研究旨在探讨RNA结合蛋白UPF1与长链非编码RNA PVT1能否调控子宫内膜癌干细胞的自我更新等生物学行为,进一步深入分析其潜在的分子机制,即UPF1通过增加PVT1的稳定性下调miR-508-5p并上调SOX2的表达,促进子宫内膜癌干细胞自我更新以及其他恶性生物学行为,为子宫内膜癌的治疗靶点提供新的理论和实验依据。方法:首先应用qRT-PCR与Western-blot方法检测在人子宫内膜癌组织中UPF1的表达水平,并分析其与子宫内膜癌患者临床病理参数之间的关系。应用qRT-PCR方法检测在人子宫内膜癌组织中miR-508-5p的表达水平,并分析其与临床病理参数之间的关系。培养人子宫内膜癌细胞系Ishikawa并利用无血清悬浮培养法与流式分选法提取Ishikawa-ECSCs。接下来,应用荧光原位杂交联合免疫荧光技术通过双光子共聚焦显微镜观察UPF1与PVT1在亲本细胞及ECSCs中的表达与分布。应用RIP-seq技术及RIP实验验证UPF1和PVT1的靶向结合作用。应用qRTPCR方法检测UPF1与PVT1在子宫内膜癌亲本细胞与ECSCs中的表达。应用细胞转染方法构建UPF1、PVT1过表达及沉默的子宫内膜癌亲本细胞及ECSCs细胞系,应用qRT-PCR或Western-blot方法检测转染效率。在过表达或沉默UPF1及UPF1与PVT1共转染的亲本细胞和ECSCs中,应用稳定性实验检测PVT1半衰期的变化;应用Western-blot方法检测干细胞相关基因SOX2、OCT4和NANOG蛋白的表达变化;应用成球实验检测自我更新能力的变化;应用CCK-8实验检测增殖能力的变化;应用Transwell实验检测迁移和侵袭能力的变化;应用流式细胞仪检测周期以及凋亡能力的变化。最后,应用star Base3.0等生物信息学软件及双荧光素酶基因报告系统验证miR-508-5p与PVT1、SOX2的靶向结合作用及结合位点。应用细胞转染方法构建miR-508-5p过表达及沉默的子宫内膜癌亲本细胞及ECSCs细胞系,应用qRTPCR方法检测转染效率。应用Western-blot、成球实验、CCK-8、Transwell、流式细胞仪分别检测过表达或沉默miR-508-5p和PVT1与miR-508-5p共转染对亲本细胞与ECSCs中SOX2等蛋白的表达以及细胞自我更新、增殖、迁移和侵袭、周期、凋亡能力的影响。结果:在本研究中,UPF1在子宫内膜癌组织和ECSCs中高表达,且与肌层浸润深度≥1/2、FIGO分期III-IV期相关(P<0.001)。CCK-8实验显示沉默UPF1能抑制ECSCs增殖能力,Transwell实验显示沉默UPF1能抑制ECSCs迁移和侵袭能力,流式实验显示沉默UPF1后进入G2-M期的ECSCs数目明显减少,ECSCs整体凋亡率(早期凋亡+晚期

关键词： miR-519d-3p   肝星状细胞   活化   增殖   凋亡  

摘要： 目的:初步探讨miR-519d-3p对LX-2细胞株生物学功能影响的研究。方法:1.将miR-519d-3p分子模拟剂(miR-519d-3p mimics)、抑制剂(miR-519d-3p inhibitor)及其阴性对照物(mimics NC、inhibitor NC)转染LX-2细胞,利用实时定量PCR检测miRNA-519d-3p在转染后LX-2细胞中的相对表达量;2.利用实时定量PCR和Western-blot检测转染后LX-2中活化标志物α平滑肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)的mRNA和蛋白的表达水平,分析miR-519d-3p对LX-2细胞活化的影响;3.采用CCK-8试剂盒检测miR-519d-3p对LX-2细胞增殖的影响;4.采用流式细胞术检测转染后LX-2的凋亡率,分析对LX-2细胞凋亡的影响;5.采用细胞划痕实验检测miR-519d-3p对LX-2细胞迁移的影响。结果:***-519d-3p转染LX-2细胞后,实时定量PCR结果显示,miR-519d-3p mimics组的miR-519d-3p相对表达量明显高于对照组(con)与mimics NC组(P<0.01);miR-519d-3p inhibitor组的miR-519d-3p相对表达量明显低于对照组与inhibitor NC组(P<0.01)。***-519d-3p转染LX-2细胞后,实时定量PCR和Western-blot结果表明,过表达miR-519d-3p可抑制LX-2细胞的活化,与对照组相比,其活化标志物α-SMA和CollagenⅠ在mRNA和蛋白水平表达降低(P<0.01);下调miR-519d-3p在LX-2细胞的表达量可促进LX-2细胞的活化,与对照组相比,α-SMA和CollagenⅠ在mRNA和蛋白水平表达升高(P<0.01)。***-519d-3p转染LX-2细胞后,与对照组相比,过表达miR-519d-3p可抑制LX-2细胞的增殖能力(P<0.01);相反,下调miR-519d-3p在LX-2细胞的表达量后,可促进LX-2细胞的增殖能力(P<0.01)。***-519d-3p转染LX-2细胞后,与对照组相比,过表达miR-519d-3p可以显著促进LX-2细胞凋亡(P<0.01);相反,下调miR-519d-3p在LX-2细胞中的表达量,可以显著抑制LX-2细胞凋亡(P<0.01)。***-519d-3p转染LX-2细胞后,细胞划痕实验结果显示,与对照组相比,过表达miR-519d-3p可以抑制LX-2细胞的迁移能力(P<0.01);相反,下调miR-519d-3p在LX-2细胞的表达量后,可促进LX-2细胞的迁移能力(P<0.01)。结论:***-519d-3p可抑制LX-2细胞的活化与增殖***-519d-3p可促进LX-2细胞的凋亡***-519d-3p具有抑制LX-2细胞的迁移能力

关键词： 真核翻译起始因子6   胃癌   细胞生物学   细胞周期  

摘要： 目的:胃癌(gastric carcinoma,GC)是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一,我国胃癌发病率和死亡率在36种癌症类型中均居第三位。目前主要采用手术结合放化疗,依据病人具体情况定制个体化治疗,但由于大多数患者发现时已是晚期,胃癌的预后并未得到实质性的改善。现有研究表明,胃癌的发生发展是及其复杂,由多基因、多因素、多步骤参与,需从分子及基因水平进一步探索胃癌的发生发展机制,以期提供新的治疗生物标记物和靶标。真核翻译起始因子6(Eukaryotic translation initiation factor 6,eIF6)是真核翻译因子家族中的一员,在翻译起始过程中具有抗结合特性,能阻止60S核糖体亚基与40S核糖体亚基过早结合,并参与核糖体生成过程。近年来研究表明,eIF6在多种恶性肿瘤中过表达,很可能是一种促癌基因,但eIF6在胃癌中的作用和机制尚不清楚。本实验旨在初步探讨在胃癌组织和胃癌细胞中eIF6的作用和功能,进而为胃癌的发生发展提供新的理论依据。方法:1.采用免疫组织化学技术检测eIF6在人胃癌组织芯片HStm A180Su08～M～047中的表达情况。结合病史资料,分析eIF6在癌组织中的表达与各组临床病理参数之间的关系。2.利用RT-q PCR、Western Blot实验从HGC27,SGC7901,AGS,MGC803,BGC823五株细胞株中筛选出eIF6 m RNA水平及蛋白表达均较高的细胞株AGS和MGC803。3.利用RT-q PCR和Western Blot方法从三条eIF6基因si RNA片段中筛选出干扰效率高的si RNA-2和si RNA-3。4.利用si RNA转染技术建立沉默eIF6的胃癌细胞株AGS和MGC803。利用CCK8实验、平板克隆实验、划痕实验、Transwell侵袭实验检测沉默eIF6对胃癌细胞AGS及MGC803包括体外增殖能力、集落克隆能力、迁移能力及侵袭能力在内的生物学行为的影响。5.利用流式细胞仪检测沉默eIF6对胃癌细胞株AGS和MGC803细胞周期的影响,Western blot实验检测沉默eIF6对胃癌细胞株AGS和MGC803细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)表达水平的影响。结果:1.免疫组织化学技术检测分析结果显示:eIF6蛋白在癌组织的表达强度高于癌旁组织(P<0.001),证实eIF6蛋白在胃癌组织中表达上调。eIF6表达水平仅与p TNM分期有统计学相关性(P=0.007),与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、有无淋巴结转移及有无远处转移无统计学相关性(P>0.05)。***8实验检测结果显示:沉默eIF6后,检测24h、48h、72h、96h四个时间点各组细胞的OD值。沉默组AGS/MGC803细胞OD值较对照组明显降低,提示沉默eIF6基因能够降低胃癌细胞体外增殖能力。3.平板克隆实验结果显示:沉默eIF6后AGS/MGC803细胞株细胞集落形成数目较对照组明显减少,提示沉默eIF6基因可以降低胃癌细胞集落形成能力。4.划痕实验结果显示:沉默eIF6后AGS/MGC803细胞株较对照组24h、48h的迁移率降低,提示沉默eIF6可以降低胃癌细胞的体外迁移能力。***实验结果显示:沉默eIF6基因后的AGS/MGC803细胞株穿过小室的细胞较对照组明显减少(P<0.05),提示沉默eIF6可以降低胃癌细胞的体外侵袭能力。6.流式细胞仪检测沉默eIF6后AGS/MGC803细胞株结果显示:沉默eIF6将胃癌细胞AGS/MGC803细胞周期阻滞在G2/M期,Western blot实验检测此时细胞中周期蛋白Cyclin B1水平,发现其表达下降,提示沉默eIF6可通过将AGS/MGC803细胞阻滞在G2/M期来抑制细胞分裂从而降低其增殖能力。结论:***6在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织,其表达水平与p TNM分期有关,与其它临床病理参数无关。2.沉默eIF6基因能抑制胃癌细胞株AGS及MGC803体外增殖、迁移及侵袭的能力,推测eIF6基因在胃癌发挥促癌作用。3.沉默eIF6基因能将胃癌细胞株AGS及MGC803细胞周期阻滞在G2/M期,周期蛋白Cyclin B1的表达水平下降。

关键词： 乳腺癌   白细胞介素10   MCF7和MDA-MB-231细胞系   增殖和凋亡  

摘要： 乳腺癌(Breast cancer,BC)是女性最常见的癌症之一,也是女性第二大癌症死因。BC具有异质性,包括20多种不同的组织病理亚型。乳腺癌的病因尚未确定,但往往与生活方式、遗传和环境等多种因素有关。根据雌激素(estrogen receptor,ER+)、孕酮(progesterone receptor,PR+)和人表皮生长因子受体 2(human epidermal growth factor receptor 2,her2)的状态,BC可分为5个主要的分子亚型。在肿瘤发生发展的过程中,肿瘤细胞通过促进辅助性T细胞向TH2(T helper cells 2,TH2)表型分化,并通过促进抑制因子的产生和抑制固有和适应性免疫系统功能,产生免疫耐受。在全身范围内,肿瘤细胞通过减少抗原呈递和分泌免疫抑制性细胞因子,以逃避机体的免疫识别并促进肿瘤细胞持续生长,最终导致耐药变体的克隆性扩增。白细胞介素10(interleukin-10,IL10)细胞因子家族由9个家族成员组成,即IL10、IL19、IL20、IL22、IL24 和 IL26,以及Ⅲ型干扰素(Type Ⅲ interferons,IFN)IL28A、IL28B和IL29。IL10是1989年由Mosmann及其同事发现的一种由小鼠TH2细胞产生的细胞因子,能够抑制1型辅助性T细胞(type 1 helper T cells,TH1)型细胞因子的产生和活性,最初也被称为细胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor,CSIF)。成熟的IL10由160个氨基酸组成,形成分子量约18kDa的单体结构。IL10作为一种抗炎细胞因子,主要由单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞(主要是Breg细胞)、巨噬细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞分泌,甚至由肿瘤组织分泌。IL10可抑制包括促炎细胞因子、趋化因子和趋化因子受体等在内的多种基因的表达,是一种具有免疫抑制和抗血管生成的多功能免疫调节因子,在包括肿瘤在内的多种疾病中发挥着重要作用。IL10是肿瘤诊断和治疗的生物标志物之一,此外,它也参与多种信号通路,与疾病的发病机制相关,并在一些肿瘤如乳腺癌的组织和血液中表达。IL10在肿瘤发生发展中的作用目前尚有争议,不同的研究结论也不一致。有研究发现,正常乳腺组织不表达IL10蛋白,但IL10在乳腺癌组织中显著升高,尤其是PR和ER阴性的乳腺癌患者。乳腺癌组织中IL10 mRNA水平较正常乳腺组织明显升高。IL10在动物模型和人类肿瘤中的表达与肿瘤免疫反应相关。有的研究认为IL10是乳腺癌的不良预后因子之一,BC患者血液中IL10水平高于正常对照组,且与预后呈负相关,IL10可刺激肿瘤细胞的增殖和转移。但另一些研究则认为IL10水平与肿瘤的分级无关;BC患者与乳腺活检阴性的可疑患者之间的血清IL10水平无明显差异。因此,IL10在乳腺癌中的作用尚需进一步的研究证实。本课题旨在进一步研究IL10对乳腺癌细胞的生物学功能的影响,特别是在乳腺癌细胞增殖和凋亡中的作用。在体外实验中,我们采用不同浓度的IL10,通过不同方法处理乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231,研究其增殖和凋亡改变情况。本研究深入探讨了 IL10在MCF7和MDA-MB-231细胞增殖和凋亡中的作用机制,以及IL10与乳腺癌激素标志物的相关性(MCF7是雌激素受体(ER)和孕激素受体(ER)阳性、HER2阴性细胞系,MDA-MB-231是三阴性(riple-negative,TN)细胞),本研究的实施对于乳腺癌的临床治疗研究具有一定的实践意义。IL10的表达与凋亡相关的肿瘤标志物有关,即与p53呈负相关,与Bcl2蛋白家族呈正相关。然而,IL10的存在和Bc12在肿瘤中浓度的增加可能提示乳腺癌的侵袭性。同样的研究也显示IL10水平与Bax的表达高度正相关,尽管Bax是Bcl2家族的一部分,是一种促凋亡的影响。细胞信号在包括乳腺癌转移在内的不同细胞过程中起着重要作用,一些长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)主要与某些信号通路相关,这些信号通路对乳腺癌转移和转移相关基因表达的复杂级联反应也是必不可少的。新的研究表明,信号转导lncRNAs可以作为不同途径的调节因子,如TGF β、NFκb、STAT3、Hippo、EGF、Wnt、PI3K/AKT、p53 等信号通路。研究发,lncRNA ANCR 通过抑制 RUNX2的表达参与TGFβ信号通路,进一步抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。本研究主要关注IL10在乳腺癌中的生物学作用。取传代10代后的MCF7和MDA-MB-231乳腺癌细胞系,将不同浓度梯度的IL10刺激乳腺肿瘤细胞,用CCK8(Cell Cou

关键词： VIT-ALK   艾乐替尼   生物学功能   肺癌  

摘要： 研究目的:在细胞水平上探讨艾乐替尼对表达融合基因VIT-ALK细胞生物学功能的影响。研究方法:采用慢病毒转染构建稳定表达VIT-ALK的HEK-293-VIT-ALK细胞作为实验组,HEK-293细胞为阴性组。RT-PCR和Western blot用于从mRNA和蛋白水平对细胞融合基因的表达进行验证。通过药物敏感性实验确定两组细胞的IC50值。采用CCK-8法,Annexin V单染法和PI-FACS法,研究艾乐替尼对表达VIT-ALK融合基因细胞的增殖能力、凋亡情况及细胞周期的影响。通过Western blot研究艾乐替尼对表达VIT-ALK融合基因细胞Akt磷酸化水平的影响。研究结果:成功转染后的HEK-293-VIT-ALK细胞VIT-ALK的mRNA表达量是HEK-293 细胞的 604.580±84.278 倍,且 Western blot 证实在 HEK-293-VIT-ALK 中ALK蛋白的表达为阳性,表明成功构建稳定表达VIT-ALK的HEK-293-VIT-ALK细胞。药敏实验中,用浓度为 0nM,50nM,100nM,500nM,1000nM,5000nM,10000nM,50000nM的艾乐替尼干预HEK-293和HEK-293-VIT-ALK,测得两组细胞的IC50值分别为18077nM和3233nM。CCK-8法试验表明,予艾乐替尼干预后第5天,HEK-293-VIT-ALK 细胞的 OD450 由加药前的 0.905±0.004 降至 0.59±0.008,两者具有统计学差异(P<0.05),表明表达VIT-ALK融合基因细胞的增殖能力受到抑制。Annexin V单染试验表明,艾乐替尼干预48小时后,HEK-293-VIT-ALK细胞组的细胞凋亡率由干预前的10.27±0.25上升至42.03±0.92,两者具有统计学差异(P<0.05),表明表达VIT-ALK融合基因细胞受干预后细胞凋亡水平增加。PI-FACS法显示,HEK-293-VIT-ALK细胞组G1期、S期和G2/M期的百分比分别为30.22±0.603,35.43±0.592和34.52±0.495;艾乐替尼干预48小时后,各细胞周期的百分比分别变化为30.01 士0.891,31.8±1.247 和 38.19±0.936。S 期缩短而 G2/M 期延长,且与加药前相比均有统计学差异(P<0.05),G1期无统计学差异(P=0.76)。表明艾乐替尼主要通过影响表达VIT-ALK融合基因细胞G2/M期的阻滞从而对细胞增殖产生影响。Western blot显示予艾乐替尼干预能抑制Akt磷酸化,从而降低Akt的蛋白磷酸化水平。结论:ALK抑制剂艾乐替尼抑制表达VIT-ALK融合基因细胞的细胞活性,主要表现为增殖减弱和凋亡增加,其中相关机制可能与G2/M期阻滞和抑制Akt磷酸化水平相关,这与临床上肿瘤患者从ALK抑制剂中获益相一致。

关键词： 家族性高胆固醇血症   家系图谱   基因突变   低密度脂蛋白受体   生物学功能  

摘要： 背景:家族性高胆固醇血症(Familial hypercholesterolemia,FH)是一种由于低密度脂蛋白受体(Low-density lipoprotein receptor,LDLR)介导的胆固醇代谢相关基因发生有害突变所致的常染色体遗传性疾病。FH患者典型的临床表现包括低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein cholesterol,LDLC)异常升高,早发的心血管动脉粥样硬化疾病以及黄色瘤、角膜弓等。本研究目的是对FH患者进行家系调查并筛选出与FH相关的基因突变位点,通过功能实验明确相关基因突变的细胞生物学意义。方法:(1)对基于荷兰脂质临床网络标准(Dutch lipid clinic network criteria,DLCN)诊断为FH的先证者进行家系调查并绘制家系图谱。(2)收集所有家系成员的血样进行全外显子测序及Sanger一代测序,结合测序结果、生物信息分析结果及FH患者表型筛选出FH相关基因突变位点。(3)通过外源性导入突变型质粒构建HEK293细胞模型,利用Western blot方法检验基因突变对LDLR蛋白表达水平的影响。(4)为进一步明确LDLR突变对细胞生物学功能的影响,我们将Dil标记的LDL与转染质粒后的HEK293细胞共孵育,采用共聚焦激光扫描显微镜分析比较野生型与突变型LDLR蛋白摄取LDL能力的差别。结果:(1)在本研究中,我们纳入了3位FH先证者并对其进行家系调查,结果显示FH符合常染色体遗传病的特征。(2)随后,通过全外显子测序在这3个FH家系中发现3个可能致病的LDLR基因突变位点(LDLR c.C501A、c.G226C、c.G1003T)。(3)通过生物信息学软件对3个LDLR基因突变位点进行功能预测,结果显示这3个位点的氨基酸序列在各物种中均高度保守。其中,LDLR c.C501A突变为终止突变,提示第167位氨基酸由半胱氨酸变为终止密码子(LDLR p.C167X)。而LDLR c.G226C、c.G1003T为错义突变,可引起氨基酸序列的改变从而影响LDLR蛋白的功能。其中,LDLR c.G226C突变使得第76位氨基酸由甘氨酸变为精氨酸(LDLR p.G76R),LDLR c.G1003T则引起第335位氨基酸的甘氨酸变为半胱氨酸(LDLR p.G335C)。(4)进一步分析FH患者的表型,结果提示LDLR c.C501A导致的终止突变较LDLR c.G226C、c.G1003T导致的错义突变所引起FH患者的血脂水平更高,动脉粥样硬化程度更严重。(5)Western blot结果显示LDLR c.C501A突变可导致LDLR蛋白表达下降,而LDLR c.G226C、c.G1003T突变则对LDLR蛋白表达无明显影响。(6)细胞功能实验结果显示:与野生型LDLR相比,3个LDLR基因突变位点(LDLR c.C501A、c.G226C、c.G1003T)均能引起LDLR摄取LDL能力下降(P<0.01)。结论:LDLR c.C501A,c.G226C,c.G1003T这三种突变均为FH的致病突变。

关键词： 肿瘤转移   循环肿瘤细胞   上皮间质转化   细胞存活   MT2   自噬  

摘要： 肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要因素,目前对于肿瘤转移的分子机制仍未被阐明。循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells,CTCs）是脱离于肿瘤原发部位和远处转移灶进入血液中的肿瘤细胞,在远处靶器官滞留形成肿瘤转移灶。循环肿瘤细胞在血道转移中扮演了重要角色,研究循环肿瘤细胞生物学特性对于阐明肿瘤转移分子机制至关重要。目的:本课题以乳腺癌循环肿瘤细胞和黑色素瘤循环肿瘤细胞作为研究对象,体内外实验研究循环肿瘤细胞的增殖、侵袭迁移、化疗药物敏感性和血液中的存活情况等生物学特性,探讨循环肿瘤细胞在血液中存活的机制;进一步阐明循环肿瘤细胞在肿瘤血道转移中的作用和相关分子机制。方法:1.4T1乳腺癌细胞建立乳腺癌原位肿瘤模型,B16黑色素瘤细胞建立黑色素瘤实验性肺脏转移模型;Ficoll密度梯度离心方法分离循环肿瘤细胞,并命名为4T1-CTCs和B16-CTCs;分别用免疫组化染色、RT-PCR检测上皮标记物和体内致瘤实验鉴定CTCs。蛋白质免疫印迹法检测CTCs中E-cadherin和Vimentin表达,流式细胞术检测CTCs上皮标记物Ep CAM和间叶标记物Vimentin阳性率,鉴定CTCs EMT不同表型。***实验和细胞克隆形成实验检测CTCs增殖和克隆形成能力;流式细胞术检测CTCs周期分布情况;蛋白质免疫印迹法检测CTCs周期相关蛋白CDK6表达;体内致瘤实验检测CTCs生长情况;免疫组织化学方法检测组织中Ki-67表达情况;MTT法检测CTCs对化疗药物敏感性。3.划痕实验和Transwell迁移实验检测CTCs迁移能力;Transwell侵袭实验检测CTCs侵袭能力;激光共聚焦显微镜检测肿瘤细胞CTCs骨架蛋白F-actin分布情况;肺脏转移实验检测CTCs肺转移情况。4.悬浮培养和流体剪切力处理细胞后检测细胞EMT标记物（E-cadherin,Ep CAM和Vimentin）表达情况。5.定量iTRAQ蛋白组学分析乳腺癌CTCs差异蛋白,使用GO数据库、KEGG数据库和String网站进行生物信息学分析;Kaplan-Merier Plotter数据库（http://***/analysis）分析MT2与乳腺癌患者预后之间的关系;String数据库在线分析MT2与凋亡自噬相关蛋白之间的相互作用,Gene MANIA数据库分析MT2与凋亡相关信号通路相关蛋白之间的相互作用。6.流式细胞术检测CTCs血液存活情况、细胞失巢凋亡抵抗能力;剪切力诱导凋亡实验检测细胞对流体剪切力抵抗情况;Transwell趋化外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）实验检测细胞对CD4T淋巴细胞和CD8T淋巴细胞的趋化能力;流式细胞术检测细胞表面免疫逃逸相关蛋白PD-L1和CD47表达。7.蛋白质免疫印迹方法和细胞免疫组化方法检测CTCs中MT2表达水平;慢病毒干扰CTCs MT2蛋白,蛋白质免疫印迹方法检测慢病毒干扰效率、凋亡相关蛋白caspase-3和自噬相关蛋白LC3 I及LC3 II;流式细胞术检测PI阳性细胞百分比。结果:1.分离和鉴定不同EMT表型的4T1乳腺癌CTCs:建立4T1乳腺癌原位肿瘤模型30天,心脏采血后,使用Ficoll密度梯度离心分离血液中CTCs,从18只小鼠血液中分离出以上皮细胞为主的CTCs和以间叶细胞为主的CTCs,本实验中以4T1CTC-1作为上皮细胞为主CTCs的代表,4T1CTC-2作为间叶细胞为主CTCs的代表。（1）通过细胞标记物鉴定4T1乳腺癌CTCs:4T1CTC-1中Ep CAM+Vimenin+细胞占85.8%,4T1CTC-2中Ep CAM-Vimentin+细胞占69.4%;RT-PCR结果显示4T1CTC-1高表达上皮标记物（E-cadherin,Ep CAM和CK）(p<0.05或p<0.001),4T1CTC-2低表达上皮标记物（E-cadherin,Ep CAM和CK）(p<0.001);蛋白质免疫印迹法结果显示4T1CTC-1高表达E-cadherin和Vimentin（p<0.05）,4T1CTC-2低表达E-cadherin而高表达Vimentin（p<0.001）。证实分离的细胞来源于4T1乳腺癌,且具有不同EMT表型。（2）通过皮下成瘤能力鉴定乳腺癌CTCs:体内致瘤实验显示4T1CTC-1和4T1CTC-2均可形成肿瘤,且肿瘤组织HE染色结果显示4T1CTC-1和4T1CTC-2形成的肿瘤组织核大深染、异型明显,并且可见病理性核分裂像。皮下致瘤实验表明4T1CTCs具有致瘤能力,4T1CTC-1和4T1CTC-2均为肿瘤来源细胞。2.分离和鉴定B16黑色素瘤CTCs:使用Fi

关键词： HCT-116   超级增强子   EphA2   CRISPR/Cas9  

摘要： 超级增强子(Super Enhancers,SEs)是基因组上一段具有高度活性和细胞类型特异性的DNA序列,通过调节细胞类型特异性基因的时空表达从而决定细胞的命运。研究表明,超级增强子不仅可以驱动非编码RNA(non-coding RNAs,nc RNAs)的转录表达,间接调节生物功能,而且在肿瘤的发生和发展过程中起关键作用。在前期研究中识别并鉴定了一个在多种肿瘤中具有活性的新型超级增强子EphA2-SE,但其组分增强子在结肠癌中的具体作用机制还未知。因此,本课题通过建立EphA2-SE组分增强子的敲除细胞系进一步探究其在结肠癌发生发展的功能。首先本课题利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在HCT-116细胞中构建EphA2-SE组分增强子缺失的敲除细胞系,并通过检测发现没有发生脱靶效应。实时定量PCR、Western Blot以及免疫荧光实验的结果显示EphA2-SE及其组分增强子的缺失能够降低靶基因EphA2在HCT-116细胞中的表达。而MTT比色法、细胞平板克隆实验以及Transwell实验的结果表明EphA2-SE及其组分增强子的缺失能够抑制HCT-116细胞的增殖、迁移和侵袭能力。综上所述,EphA2-SE及其组分增强子通过影响靶基因EphA2的表达从而介导结肠癌HCT-116细胞的生物学特性,为进一步阐明超级增强子在肿瘤发生发展中的功能奠定良好的基础。

关键词： 牙周膜干细胞   巨噬细胞   极化   多向分化  

摘要： 目的:牙周膜干细胞(PDLSCs)是一种间充质干细胞,具有较强的体外增殖和体内组织再生能力。巨噬细胞广泛于存在于所有组织当中,具有免疫、修复再生和维持机体内环境稳定的功能。本研究通过将巨噬细胞的培养上清液与PDLSCs共培养,观察巨噬细胞对PDLSCs的形态、增殖、凋亡、克隆形成以及多向分化的影响,为PDLSCs应用于组织再生提供更多的实验依据。 方法:收集拔除的阻生牙以及正畸减数牙,通过组织块培养的方法进行PDLSCs的原代培养。在本实验中,采用THP-1来源的巨噬细胞,将THP-1细胞用佛波醇脂(PMA,50 ng/m L)诱导培养24小时使之贴壁。在此基础之上再对巨噬细胞进行诱导,诱导方案如下所述。M1诱导:脂多糖(LPS,10 ng/m L)+干扰素-γ(IFN-γ,20 ng/m L)诱导24小时;M2诱导:IL-4(20 ng/m L)+IL-13(20 ng/m L)诱导24小时;M0诱导:PMA诱导THP-1 48小时。诱导结束后,换液,ɑ-MEM培养24小时,收集上清液,作为条件培养基(CM)-80℃条件下保存,M0、M1、M2巨噬细胞的条件培养基分别称为CM0、CM1、CM2,以备下一步实验使用。(1)将P2-P5的PDLSCs与不同类型巨噬细胞CM共培养24小时,分别进行以下实验:在光镜下观察PDLSCs的形态变化;EDU染色和EDU流式细胞术观察PDLSCs增殖能力的变化;Annexin V-FITC试剂盒染色观察PDLSCs的凋亡情况。(2)PDLSCs在不同类型巨噬细胞CM中培养7天后,观察PDLSCs克隆形成能力的变化。(3)用不同类型巨噬细胞CM配制成骨诱导液、成脂肪诱导液,诱导培养PDLSCs 21天,观察PDLSCs多向分化能力的变化。 结果:(1)与在正常培养基中生长的PDLSCs相比,在不同类型巨噬细胞CM中培养的PDLSCs,形态从梭形变为更加细长的梭形。(2)与在正常培养基中培养的PDLSCs相比,不同类型巨噬细胞CM中共培养的PDLSCs的增殖能力减弱(P<0.001)。(3)与在正常培养基中培养的PDLSCs相比,CM1中培养的PDLSCs的凋亡率最低(P<0.0001),CM2中培养的PDLSCs的凋亡率较低(P<0.0001),而CM0中培养的PDLSCs的凋亡率最高(P<0.0001)。(4)与在正常培养基中培养的PDLSCs相比,不同类型巨噬细胞CM中培养的PDLSCs的克隆形成能力几乎丧失。(5)与普通成骨诱导液中培养的PDLSCs相比,CM0成骨诱导液中培养的PDLSCs的矿化结节最多(P<0.01),CM1成骨诱导液中的矿化结节次之(P<0.01)。在CM0、CM1、CM2成脂肪诱导液培养的PDLSCs中,CM1中的PDLSCs成脂肪能力最强。 结论:(1)巨噬细胞的CM可以改变PDLSCs的形态。(2)巨噬细胞的CM可以抑制PDLSCs的增殖。(3)巨噬细胞的CM可以促进PDLSCs的凋亡。(4)巨噬细胞的CM可以抑制PDLSCs的克隆形成。(5)CM0促进PDLSCs成骨的能力最强,CM1促进PDLSCs成脂肪的能力最强,CM2抑制PDLSCs成脂肪。