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关键词： 间充质干细胞   脂肪   肥胖   生物学功能   细胞衰老  

摘要： 背景:间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类自我更新能力强,并具有多向分化、支持骨髓造血、调节免疫和炎症等多种功能的干细胞,在再生医学和细胞治疗中具有重要应用价值。脂肪组织是MSCs的重要来源。细胞微环境如炎症、缺氧等可影响细胞的活性和功能,甚至诱导细胞衰老。肥胖可诱导机体产生多种病理变化,包括全身和脂肪组织局部的慢性炎症病变等,那么肥胖对脂肪组织来源的间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)的生物学功能会产生哪些影响?是否诱导ADSCs的衰老?目的:本课题以高脂饮食诱导的肥胖小鼠以及肥胖患者来源的ADSCs为研究对象,探讨肥胖对其生物学功能和细胞衰老的影响。方法:1.选取20只体重约20 g的健康、清洁级5周龄C57BL/6J小鼠,雌雄各半,随机分为对照组和肥胖组,每组10只。肥胖组小鼠通过高脂饮食喂养14周,对照组通过普通饮食喂养14周。分离小鼠皮下和腹股沟及肾周内脏脂肪组织,提取并培养ADSCs。选用第一代ADSCs,利用流式细胞术检测其表面分子,通过CFU-F(colony forming unit-fibroblasts)实验、CCK8试剂盒检测细胞增殖能力,通过transwell实验检测细胞迁移能力,通过分化诱导实验检测其成骨、成软骨和成脂分化的能力;通过β-半乳糖甘酶(β-Galactosidase,β-gal)染色检测细胞衰老水平。2.选取武汉大学中南医院肝胆病区肝血瘤手术患者(对照组)及肥胖与减重中心的减重手术患者(肥胖组)各6例,年龄15-45岁;收集患者的血清及皮下和内脏脂肪组织。分离并培养ADSCs,检测细胞增殖、迁移和分化能力,检测细胞内活性氧水平(reactive oxygen species,ROS)及β-gal的活性;通过ELISA试剂盒检测血清中炎性因子IL-6、IL-8、IL-10的水平。结果:显微镜下观察,小鼠ADSCs细胞为长梭形或纺锤形,聚集在一起呈旋涡状。流式细胞术检测结果显示细胞表面高表达CD29和CD90,而CD11b与CD45的表达水平低下。与对照组相比,肥胖组内脏和皮下ADSCs的增殖(p<0.05)和迁移能力下降(p<0.001),成骨、成软骨细胞分化能力亦降低(p<0.01),但肥胖组ADSCs分化为脂肪细胞的能力增强(p<0.01),细胞中β-gal活性增加(p<0.01)。流式细胞术检测结果显示,人ADSCs表面高表达CD73和CD90,而CD11b与CD45表达水平低下。与对照组相比,肥胖组ADSCs细胞增殖、分化为骨的能力降低(p<0.001),分化为软骨细胞的能力也降低(p<0.01),但分化为脂肪细胞的能力增强(p<0.01),迁移能力和细胞内ROS水平升高(p<0.001)以及β-gal活性增加(p<0.01)。并且,内脏与皮下脂肪来源的ADSCs变化趋势一致。肥胖组患者血清中促炎因子IL-6和IL-8表达增多(p<0.01),抗炎因子IL-10表达降低(p<0.05)。结论:肥胖显著影响小鼠和人体内ADSCs的生物学功能,降低ADSCs的增殖和成骨、软骨细胞分化能力,但增强其成脂分化能力,并促进ADSCs的衰老。

关键词： 癌相关成纤维细胞   间质-上皮转化   口腔   鳞状细胞癌   细胞生物学特性  

摘要： [研究背景] 肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是肿瘤发生和生存的内环境,其在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。癌相关成纤维细胞(carcinomaassociated fibroblasts,CAFs)是TME中最重要的间质细胞之一,可与上皮细胞进行“交互对话”从而促进上皮细胞的恶性转化及发展。本课题组前期发现口腔CAFs可向上皮样转化的新现象,由此我们提出两个问题:1.上皮化CAFs自身的生物学特性是否会发生变化?2.上皮化CAFs是否对口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的细胞生物学特性产生影响?本课题对以上问题进行研究,这对了解CAFs的上皮样转化特点,探索肿瘤微环境对OSCC进展的影响具有较重要的理论意义和应用价值。 [研究目的] 1.优化实验条件,获得足够的上皮化口腔CAFs; 2.观察上皮化口腔CAFs的生物学特性变化; 3.研究上皮化CAFs对口腔鳞癌细胞生物学特性的影响。 [研究方法] 1.采用组织块法、胰酶消化法培养及纯化口腔CAFs原代细胞,并用免疫细胞化学技术对口腔CAFs进行鉴定; 2.采用慢病毒转染法对口腔CAFs以获得上皮化CAFs; 3.采用CCK-8细胞增殖实验、Transwell小室细胞侵袭实验及细胞划痕愈合实验对上皮化口腔CAFs自身的增殖、侵袭及迁移特性进行研究; 4.采用CCK-8细胞增殖实验、Transwell小室细胞侵袭实验、细胞划痕愈合实验研究上皮化CAFs对Cal27细胞增殖、侵袭和迁移特性的影响。 [研究结果] 1.原代细胞传至第三代可获得纯化的口腔CAFs,其E-Cadherin和Pan-CK呈阴性表达,α-SMA、FAP、FSP1和Vimentin呈阳性表达; 2.将OKSM四种因子转染口腔CAFs,部分细胞发生上皮样转化;按OK-M-S的顺序进行转染,可提高重编程效率并获得更多上皮化CAFs; 3.与对照组相比,上皮化口腔CAFs增殖特性增强,差异具有统计学意义(P=0.047);侵袭及迁移特性的差异无统计学意义(P>0.05); 4.与对照组相比,上皮化CAFs对Cal27增殖特性的促进作用增强,差异具有统计学意义(P=0.045); 5.与对照组相比,上皮化CAFs对Cal27侵袭特性的促进作用增强,差异具有统计学意义(P=0.008); 6.与对照组相比,上皮化CAFs对Cal27迁移特性的促进作用增强,差异具有统计学意义(P=0.049)。 [结论] 1.口腔CAFs可被OKSM四种重编程因子诱导发生上皮样转化; 2.上皮化口腔CAFs自身的增殖特性增强,侵袭和迁移特性无明显变化; 3.上皮化CAFs对Cal27细胞增殖、侵袭和迁移特性的促进作用增强。

关键词： 急性髓系白血病   复发/难治性   可变剪接   SRSF1   BCL2L11  

摘要： 目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类血液系统恶性增殖性疾病,其中复发难治性急性髓系白血病(refractory acute myeloid leukemia,RAML)的预后较差,寻找其发生的分子机制,进一步发现该类疾病的潜在治疗靶点十分重要。可变剪接(alternative splicing,AS)异常与AML预后关系密切。本研究通过生物信息学分析TCGA-AML数据,获得RNA剪接模式、AML表达谱及相关临床信息,构建可变剪接网络,识别与生存相关的可变剪接因子以及可变剪接事件涉及的基因,并分析可变剪接事件与AML发生及预后的相关性。检测临床样本中预后相关剪接因子SRSF1的表达水平,同时检测SRSF1与其靶基因BCL2L11对细胞生物学功能的影响,旨在阐明RAML发病分子机制,为探索RAML潜在治疗靶点奠定理论基础。方法:1.利用生物信息学获取并整合分析TCGA中AML的AS数据首先从TCGA与TCGA Splice Seq数据库中获取患者数据,再根据Percentage of Samples with PSI Value>75%,临床OS>30等标准筛选并进行研究分析;其次按照NMP1突变与否进行分组并采用R 3.5.1软件识别分析两组患者的异常AS事件;然后通过Cox回归分析识别生存相关AS事件与AS事件独立预后相关基因;同时使用David工具进行预后相关基因的GO富集分析,Cytoscape 3.6.1构建基因互作网络图;最后构建AS预后模型并找到AML预后相关的剪接因子。2.q PCR检测RAML临床骨髓样本中SRSF1表达收集治疗后预后良好的AML患者与RAML患者骨髓样本各30例,使用Trizol法从骨髓标本中提取RNA,采用实时定量PCR(q PCR)技术检测两组样本SRSF1表达情况。***1与BCL2L11不同剪接体对细胞增殖凋亡的影响首先构建SRSF1、BCL2L11-γ剪接体及BCL2L11-L剪接体的表达载体,使用Lipofectamine 2000转入细胞中;SRSF1过表达后通过CCK 8检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡;RT-PCR检测SRSF1过表达后BCL2L11-L和γ两种剪接体表达水平;最后通过CCK 8、高内涵分析系统及流式细胞术检测BCL2L11不同剪接体对细胞增殖、凋亡的影响。结果:1.从TCGA与TCGA Splice Seq数据库中最终筛选出了129名AML患者进行了AS事件的研究分析;发现在AML中,AS事件的普遍性及主要事件类型是外显子跳跃(ES);找到了BCL2L11、CASP3等239个预后相关基因;构建多个剪接预后模型并提示:AS发生较高群体的预后明显较差;同时找到了预后相关剪接因子SRSF1、RBM4等;其中,SRSF1高表达和RBM4低表达与AML预后不良有关。***骨髓样本与预后良好AML骨髓样本的q PCR结果表明,RAML组SRSF1表达显著升高,P<0.05。***1过表达促进BCL2L11-γ剪接体的形成,进而阻滞细胞凋亡,P<0.05;CCK 8实验和细胞凋亡实验结果表明:与对照组相比,高表达BCL2L11-γ剪接体后,细胞的增殖、凋亡均无明显差异,P>0.05,而高表达BCL2L11-L剪接体的细胞增殖明显下降,凋亡增加,P<0.05。结论:1.在急性髓系白血病中存在7种可变剪接事件,其中ES最多见,涉及的基因主要富集在细胞周期、有丝分裂检查点以及DNA完整性检查点等生物学过程中。可变剪接事件与AML预后相关,剪接因子SRSF1高表达与预后不良相关,而RBM4低表达与预后不良相关。2.复发性难治性急性髓系白血病患者中SRSF1表达升高。***2L11是SRSF1的重要靶基因,SRSF1过表达引起BCL2L11异常可变剪接,促进BCL2L11-γ剪接体形成,γ剪接体可能通过抑制细胞凋亡,在AML耐药及进展中发挥作用。

关键词： 骡子   诱导多能干细胞   生物学特性   体外分化   定向诱导  

摘要： 骡是马和驴种间杂交所生的杂种后代,大部分没有生殖能力。目前关于骡不育的原因还没有相关实验证明性结论。2011年,Saitou等人将小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)定向诱导为原始生殖样细胞(Primordial germ cell-like cells,PGCLCs),成功得到了存活后代,并且在小鼠iPSCs上也得到了相同结果。在之后的研究中,利用不同方法也可将人和马iPSCs定向诱导为PGCLCs。本研究尝试利用干细胞具有多能性、可以长期稳定传代等优势将本实验室建立的可育母骡iPSCs(Fertile mule fibroblasts induced pluripotent stem cells)定向诱导为PGCLCs,为研究骡不育的生殖生物学机制提供科学依据。具体实验结果如下:1.克隆形态与碱性磷酸酶染色结果显示,骡FMF-iPSCs细胞核质比大,细胞之间连接紧密,克隆形态呈不规则扁平状,界限清晰且碱性磷酸酶染色呈阳性。2.核型分析结果显示,骡FMF-iPSCs染色体数目正常2N=63/XX,基因组稳定。3.实时荧光定量PCR及免疫荧光染色结果显示,骡FMF-iPSCs在RNA、蛋白水平均表达多能性标记基因OCT4、SOX2、NANOG。4.体外EBs分化结果显示:骡FMF-iPSCs具有体外分化为三个胚层的潜能,分化产物在RNA水平分别表达内、中、外三个胚层标记基因HNF4A、HAND1、NESTIN,蛋白水平分别表达内、中、外三个胚层标记基因GATA6、T、NESTIN。5.骡FMF-iPSCs注入6.5天小鼠胚胎内Epiblast处体外培养48 h后,组织切片荧光染色结果显示,该细胞系增殖、移动,有贡献到三个胚层与早期PGCs的潜能。***定向诱导分化结果显示,三种不同诱导方法均可使FMF-iPSCs定向诱导为PGCLCs,RNA水平、蛋白水平分别表达PGCs标记基因NANOS3、BLIMP1、SOX17;VASA、BLIMP1。综上所述:本研究得到了在血清Li F培养体系中长期稳定传代的可育母骡FMF-iPSCs,该细胞系具有自我更新能力和多能性,并维持稳定的基因组特征;这类干细胞体外拟胚体分化具有贡献到三个胚层的潜能,注入6.5天小鼠胚胎内Epiblast处体外培养48h后干细胞能够增殖、移动,并贡献到三个胚层与PGCs。另一方面,通过三种不同诱导方法均可将FMF-iPSCs定向诱导为PGCLCs。上述研究探讨了骡FMF-iPSCs的干细胞特性及PGCLCs定向分化能力,为杂交动物细胞的干细胞诱导及相关研究提供重要科学依据。

关键词： 类风湿关节炎   滑膜成纤维细胞   人脐带间充质干细胞来源的外泌体   miRNA  

摘要： 背景:类风湿关节炎是一种以侵蚀性、慢性对称性多关节炎的自身免疫病,典型病理变化是关节滑膜异常增生以及软骨和骨质的破坏,FLSs在RA发病过程中发挥核心作用,RAFLSs异常表达miRNA参与RA关节炎症、滑膜增生、组织破坏;MSC-Exos为MSCs产生的30-150 nm膜分泌体系,既保留了MSCs功能,又具备精准高效的传递方式和易于保存和调控的结构优势,MSC-Exos内含的miRNA是MSC-Exos生物学效应的关键分子,miRNA在生物体内定向转运具备极髙的治疗和转化应用前景。那么hUCMSC-Exos是否可以将miRNA递送至RAFLSs并影响其生物学性状,有待进一步研究验证。目的:hUCMSC-Exos能否将RNA递送至RAFLSs;hUCMSC-Exos是否通过传递miRNA影响RAFLSs增殖、迁移。方法:***对hUCMSC-Exos RNA的摄取作用组织贴壁法分离培养原代hUCMSCs,流式细胞术鉴定表面标记,采用差速离心法联合超滤法获取hUCMSC-Exos,进一步通过电镜、纳米颗粒追踪分析、高灵敏纳米粒度分析及BCA法鉴定Exos;胰酶消化法分离培养原代RAFLSs,流式细胞术鉴定表面标志;标记hUCMSC-Exos的RNA,hUCMSC-Exos与RAFLSs共培养24h,经处理后置于荧光显微镜观察。2.构建hUCMSCs KD-Ago2慢病毒GV493感染hUCMSCs确定最适感染条件;随后分别用3个载有可敲低Ago2的不同si RNA靶点序列的慢病毒GV493感染hUCMSCs,RT-PCR法、Westen blot法检测Ago2在hUCMSCs、hUCMSCs KD-Ago2、hUCMSCs NC的表达情况,确定敲低效率最高靶点用于构建hUCMSCs KD-Ago2。3.检测hUCMSCs-Exos中miRNA对RAFLSs影响差速离心法联合超滤法获取Ago-2基因敲低的hUCMSCs来源的Exos即hUCMSCKD-Ago2-Exos、Ago-2基因未敲低的hUCMSCs来源的Exos即hUCMSCNC-Exos,采用实时无标记细胞检测仪研究不同浓度hUCMSC-Exos对RAFLSs的增殖、迁移影响,确定最适干预浓度,进一步采用实时无标记细胞检测仪比较hUCMSCKD-Ago2-Exos、hUCMSCNC-Exos及空白对照组对RAFLSs的增殖、迁移影响。结果:原代hUCMSCs呈梭形纺锤样,CD105、CD73、CD90阳性,CD45、CD34、HLA-DR阴性,符合hUCMSCs表征;原代RAFLSs形态呈纤维梭状,PDPN、CDH-11阳性、CD68阴性,符合RAFLSs表征;标记RNA的hUCMSC-Exos与RAFLSs共孵育可见蓝染的RAFLSs核周围聚集绿色荧光物质,RAFLSs可以摄取hUCMSC-Exos的RNA。慢病毒GV493感染hUCMSCs感染难度适中,感染后的细胞增殖正常,最适感染条件为添加感染增强液Hi Trans G P、MOI=20,且3个载有不同靶点序列的慢病毒均可成功感染hUCMSCs;RT-PCR和Western blot检测感染hUCMSCs中Ago2基因的敲减效率,确定病毒靶点LVPSC85386-11感染hUCMSCs用于实验。经鉴定hUCMSC-Exos、hUCMSCKD-Ago2-Exos、hUCMSCNC-Exos为直径30～150nm典型杯托状、形态完整的膜性囊泡,蛋白浓度分别为1.384ug/ul、1.133ug/ul、1.038ug/ul,上述结果均符合其标准。hUCMSCKD-Ago2-Exo、hUCMSCNC-Exos干预RAFLS,同时间点hUCMSCKD-Ago2-Exos组、hUCMSCNC-Exos组均抑制RAFLSs增殖、迁移,hUCMSCNC-Exos组作用最强,差异具有统计学意义（p<0.01、p<0.05）;干预组和空白对照组中每一组在不同时间点处的RAFLSs增值、迁移的细胞指数均具有统计学差异（p<0.01、p<0.05）,且每组组间整体均有统计学差异（p<0.01、p<0.05）。结论:hUCMSC-Exos RNA被RAFLSs摄取后可能通过miRNA影响RAFLSs增殖、迁移。

关键词： SOX9   非小细胞肺癌   肿瘤干细胞   上皮间充质转化   癌基因  

摘要： 目的:本研究旨在探究SOX9对非小细胞肺癌细胞生物学功能影响,并初步探讨其可能的调节机制,以期寻找新的非小细胞肺癌标志物及治疗靶点。方法:通过慢病毒转染人肺癌A549细胞系构建SOX9敲减的细胞,采用平板克隆、Transwell实验和成球实验分析下调SOX9后对A549细胞的增殖与迁移等生物学功能的影响。同时通过q RT-PCR及Western-blot检测干性标志物SOX2、Nanog、OCT4、SALL4及间质标记物N-cadherin在SOX9敲减的A549细胞中的表达水平。通过转录组测序分析敲减SOX9后的差异表达基因,并富集相关信号通路,以探讨SOX9调控肺癌细胞迁移、增殖和干细胞特性的可能相关机制。结果:与对照组相比,敲减SOX9组A549细胞的迁移及侵袭细胞数(P<0.01)、克隆细胞团数(P<0.01)及肿瘤干细胞球数均减少(P<0.01)。同时,敲减SOX9抑制了干性指标SOX2、Nanog、OCT4、SALL4和上皮间质转化相关指标N-cadherin的表达(P<0.05)。通过比较敲减SOX9组与对照组,共筛选出364个DEGs。GO分析显示差异表达基因涉及转化生长因子β结合、胆固醇合成及RNA聚合酶对pri-mi RNA转录的负性调控作用等生物进程。KEGG结果可见有关的信号通路包括IL-17信号途径、PPAR通路、细胞间黏附分子等。结论:1.下调SOX9抑制了A549细胞的增殖、迁移及侵袭能力,SOX9可能作为癌基因促进了非小细胞肺癌的发生发展。***9可能具有调控肺癌细胞干性及EMT过程的作用,并促进肺癌细胞的干性,抑制其分化特性。***9可能通过IL-17信号通路、PPAR信号通路等参与对肺癌干细胞的生物学调控过程。***9可能成为未来肺癌诊断的分子标志物和精确治疗的新靶点。

关键词： 卵巢癌   白介素-17D   NF-κB信号通路   p65   PD-L1  

摘要： 目的:检测重组人IL-17D(RhIL-17D)作用下,卵巢癌SKOV3细胞和si-p65-SKOV3细胞NF-κB-p65和PD-L1 m RNA及蛋白的表达情况;检测RhIL-17D对SKOV3细胞和si-p65-SKOV3细胞迁移、侵袭、增殖的影响。探究IL-17D对卵巢癌细胞PD-L1表达和生物学特性的影响及其机制。方法:1.选取处于对数生长期的SKOV3细胞,以适量细胞接种于六孔板,用含不同浓度(0ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)RhIL-17D的10%胎牛血清培养基培养细胞48小时,并收集细胞。2.应用实时荧光定量反转录多聚核苷酸酶链式反应(Quantitative re al-time reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测在不同浓度RhIL-17D作用下,SKOV3细胞NF-κB-p65和PD-L1 m RNA相对表达量的变化。3.应用Western blot方法检测不同浓度的RhIL-17D对SKOV3细胞PD-L1和NF-κB-p65的活化形式P-p65蛋白表达水平的影响。并根据qRT-PCR和Western blot结果,选取目的基因表达最高的浓度进行后续试验。4.构建si-p65-SKOV3细胞系:用si-p65转染卵巢癌SKOV3细胞,同时设置si-NC对照组和空白对照组,分别应用qRT-PCR法和Western b lot法检验敲低效率。5.应用qRT-PCR方法检测RhIL-17D对si-p65-SKOV3细胞p65和P D-L1 m RNA表达水平的影响。6.应用Western blot方法检测RhIL-17D对si-p65-SKOV3细胞p65和PD-L1蛋白表达水平的影响。7.应用MTS增殖实验分别检测RhIL-17D对SKOV3细胞和si-p65-SKOV3细胞增殖能力的影响,并绘制生长曲线。8.应用划痕实验分别检测RhIL-17D对卵巢癌SKOV3细胞和si-p65-SKOV3细胞迁移能力的影响。9.应用Transwell小室侵袭实验分别检测RhIL-17D对卵巢癌SKOV3细胞和si-p65-SKOV3细胞侵袭能力的影响。结果:***-PCR结果显示:经过含不同浓度(0ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)RhIL-17D的10%胎牛血清培养基培养,SKOV3细胞的p65 m RNA相对表达量分别为1.00±0.09、1.08±0.56、1.43±0.42、4.59±0.85、4.42±0.96,差异有统计学意义(P<0.01)。组间比较,0ng/ml组、0.1ng/ml组和1ng/ml组p65 m RNA表达水平显著低于10ng/ml组和100ng/ml组(P<0.05)。0ng/ml组、0.1ng/ml组和1ng/ml组中p65 m RN A表达水平的差异不具有统计学意义(P>0.05)。10ng/ml与100ng/ml组p65 m RNA表达水平的差异不具有统计学意义(P>0.05)。SKOV3细胞PD-L1 m RNA相对表达水平分别为1.00±0.02、1.00±0.15、1.00±0.38、2.20±0.36、2.33±0.64,差异有统计学意义(P<0.01)。组间比较,0ng/ml组、0.1ng/ml组和1ng/ml组PD-L1 m RNA表达水平明显低于10ng/ml和100ng/ml组(P<0.05)。0ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml组P D-L1 m RNA表达水平的差异不具有统计学意义(P>0.05)。10ng/ml与100ng/ml组PD-L1 m RNA的表达水平的差异不具有统计学意义(P>0.05)。*** blot结果显示,RhIL-17D可上调卵巢癌SKOV3细胞Pp65蛋白和PD-L1蛋白的表达,且呈浓度依赖性。根据以上结果,浓度为10ng/ml的RhIL-17D使目的基因表达最高,因此选用10ng/ml RhIL-17D作为后续处理浓度。3.成功设计并合成si-p65-SKOV3细胞,qRT-PCR方法结果显示,si-p65-SKOV3细胞组的p65 m RNA相对表达量低于si-NC-SKOV3细胞组和空白对照组(0.43±0.13 vs 1.02±0.26 vs 1.01±0.29,P<0.05)。Western blot显示si-p65-SKOV3细胞组P-p65蛋白表达明显低于siNC-SKOV3细胞组和空白对照组。***-PCR法结果显示,在10ng/ml RhIL-17D作用下,si-p65-SKO V3细胞组的p65 m RNA相对表达量

关键词： 医学遗传学   医学院校   教学参考资料  

ISBN: (纸本)9787030635891

摘要： 本书是《医学细胞生物学与遗传学》的配套学习指导，汇集国内8所高等医学院校长期从事医学细胞生物学与遗传学教学工作的一线教师编写而成。全书由两大部分共33章组成。在编写过程中，编者密切联系各不同学制本科生和研究生的自身特点进行了课程学习内容和课后习题的改革能够大幅度帮助学生提高学习效率。本书内容丰富新颖，语言流畅，具有较强的逻辑性和科学性。本书可供医学院校“5+3”年制、本科学生及考研人员使用，通过使用本学习指导，帮助读者相对快速、全面地学习及复习医学细胞生物学与遗传学，为参加相关考试做准备。

关键词： miR-101-5p   EZH2   山羊精原干细胞   增殖   凋亡   多能性  

摘要： 精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)的功能受到表观遗传修饰的严格调控。小RNA(Micro RNA,miRNA)和组蛋白甲基化等表观遗传学修饰从转录水平调控基因表达。miR-101通过靶基因调节细胞的增殖、分化和凋亡。果蝇Zeste基因增强子人类同源物2(Enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是组蛋白H3第27位赖氨酸(Lysine-27 of histone H3,H3K27)的甲基转移酶,在小鼠精原细胞和胚胎干细胞的增殖、分化及衰老等过程中发挥重要作用。然而,miR-101-5p和EZH2在山羊睾丸组织中的表达及对山羊SSCs的作用鲜有研究。因此,本研究首先检测miR-101-5p及EZH2在性成熟前后山羊睾丸组织中的表达,其次以山羊SSCs为研究对象,探索miR-101-5p及EZH2对山羊SSCs增殖、细胞周期及多能性的影响,旨在揭示miR-101-5p影响山羊SSCs生物学特性的分子机制。试验结果如下:试验一、miR-101-5p的表达及其对山羊SSCs增殖和凋亡的影响本试验采用q PCR解析miR-101-5p在性成熟前后山羊睾丸组织中的表达水平,并通过转染miR-101-5p的抑制剂(inhibitor)和模拟物(mimics)检测其对山羊SSCs生物学特性的影响。结果表明,与性成熟前相比,性成熟后山羊睾丸中miR-101-5p的表达水平极显著升高(P<0.01);过表达miR-101-5p后,SSCs的活力极显著下降(P<0.01),促凋亡基因CASP3和CASP9的表达极显著上升(P<0.01),而抑凋亡基因BCL-2的表达极显著下降(P<0.01),细胞周期G2/M期比例显著下降(P<0.05),多能性基因NANOG和CDX2及精子发生相关基因GDNF和DAZL的表达均极显著下降(P<0.01),但是干扰miR-101-5p后其趋势相反。上述结果说明miR-101-5p能够促进山羊SSCs的凋亡,抑制其增殖能力,阻滞细胞周期,影响多能性基因表达。试验二、miR-101-5p靶向EZH2调控山羊SSCs增殖和凋亡的研究本试验旨在探索miR-101-5p影响山羊SSCs生物学特性的分子机制,通过双荧光素酶报告载体、q PCR和Western blot试验探究miR-101-5p调节靶基因参与调控山羊SSCs增殖和凋亡的作用机理。结果表明,与共转染EZH2-WT及NC mimics相比,EZH2-WT和miR-101-5p mimics共转染后,荧光素酶活性极显著下降(P<0.01),但是其它组无显著差异(P>0.05);与NC相比,过表达miR-101-5p能够极显著降低山羊SSCs中EZH2的蛋白及m RNA水平(P<0.01)。此外,与性成熟前相比,性成熟后山羊睾丸中EZH2的表达水平极显著升高(P<0.01),进一步研究发现EZH2在山羊SSCs中的表达极显著高于(P<0.01)间质细胞和支持细胞;干扰EZH2后山羊SSCs的活力、增殖能力极显著下降(P<0.01),细胞周期G2/M期受阻(P<0.01);细胞增殖marker基因PCNA和抑凋亡基因BCL-2的表达量极显著下降(P<0.01),而促凋亡基因P53、BAK、CASP3、CASP9、BAX及BAX/BCL-2的表达水平极显著升高(P<0.01)。干扰EZH2后,山羊SSCs中PLZF、GDNF等marker基因及DAZL的表达极显著降低(P<0.01)。上述结果说明,miR-101-5p靶向EZH2促进山羊SSCs的凋亡,抑制其增殖能力,阻滞细胞周期,降低自我更新marker基因的表达,可能影响了山羊的精子发生过程。试验三、EZH2调控山羊SSCs多能性的分子机制DNA甲基化和基因组印记是基因选择性转录表达的调控方式,EZH2能够影响Dnmt1的表达,在许多基因甲基化过程中发挥重要作用。为了验证EZH2是否通过DNA甲基化影响山羊SSCs多能性及印记基因的表达,本试验通过q PCR、Western blot和BSP技术探究EZH2对山羊SSCs多能性基因、印记基因及其DNA甲基化的影响,旨在阐明EZH2调控山羊SSCs多能性的分子机制。结果表明:与NC相比,干扰EZH2后,山羊SSCs中多能性基因OCT4、NANOG及印记基因H19的表达水平均极显著降低(P<0.01),同时DNA去甲基化转移酶TETs(Tet1、Tet2和Tet3)的表达水平也极显著下降(P<0.01),而Dnmt3a和Dnmt3b的表达极显著升高(P<0.01)。此外,干扰EZH2后,NANOG基因第4个位点的甲基化水平下降,印记基因H19(P<0.05)和IGF2(P<0.01)的甲基化水平显著上升,故推

关键词： 黄连碱   仑伐替尼   基因表达谱   CDKN2C  

摘要： 【目的】探讨黄连碱联合仑伐替尼对肝癌细胞增殖和凋亡的影响,并基于基因芯片技术探讨黄连碱影响仑伐替尼对肝癌生物学效应的作用基因,并对靶基因的功能进行了验证,为进一步研究其机制提供依据。 【方法】首先通过MTT法检测黄连碱和甲磺酸仑伐替尼对人肝癌Huh-7细胞增殖的抑制率,并计算半数抑制浓度(IC50);确定甲磺酸仑伐替尼的使用浓度,并且筛选出黄连碱的适配浓度。通过CCK-8实验黄连碱和甲磺酸仑伐替尼联用干预48h对人肝癌Huh-7细胞增殖活性的影响;通过流式细胞术实验检测双药联用对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响。单用仑伐替尼、黄连碱和双药联用干预Huh-7细胞48h后,提取细胞总RNA,利用基因芯片技术,研究干预前后基因表达谱变化。以|Fold Change|≥1.3且FDR<0.05为筛选标准,筛选干预前后在单药组和双药组均下调的差异基因;通过RT-PCR法对表达丰度下调的10个差异基因表达进行验证。运用高内涵筛选（HCS）技术进一步筛选黄连碱影响仑伐替尼对人肝癌细胞生物学功能的潜在作用基因。通过RNA干扰技术构建靶基因的沉默序列,转染Huh-7细胞。基因沉默细胞系构建成功后,用单药组和双药组继续干预48h,通过CCK-8实验、流式细胞学实验、伤口愈合实验和侵袭实验验证差异基因沉默对单用仑伐替尼和仑伐替尼与黄连碱联用在调控细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。 【结果】（1）甲磺酸仑伐替尼对肝癌Huh-7细胞的IC50为13.71μM,而黄连碱的IC50为39.55μM;确定甲磺酸仑伐替尼的使用浓度为10μM,并且筛选出黄连碱的适配浓度为40μM。（2）相比于单药组,黄连碱搭配甲磺酸仑伐替尼更能显著降低肝癌Huh-7细胞的增殖活性。（3）相比于单药组,黄连碱搭配甲磺酸仑伐替尼更能显著促进人肝癌Huh-7细胞的凋亡。（4）单药组和双药组干预肝癌Huh-7影响细胞基因表达谱,共筛选出51个差异基因,以下调基因作为研究对象,筛选出10个有潜力的差异基因。（5）RT-PCR结果显示,包括CDCA8、CDKN2C和LMNB1在内的10个待研细胞表达量均为高。（6）HCS实验进一步筛选出CDKN2C可能是黄连碱增效的作用基因。（7）CDKN2C沉默能促进单用仑伐替尼组和双药联用组对肝癌Huh-7细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,并提高了肝癌Huh-7细胞的凋亡率,并且双药联用组比单用仑伐替尼组的上述效应更加突出,差异有统计学意义。 【结论】 1.黄连碱可以增强仑伐替尼抑制肝癌细胞增殖及促进肝癌细胞凋亡的作用。 2.黄连碱增强仑伐替尼对肝癌细胞生物学效应与其作用于CDKN2C密切相关,其作用机制有待深入研究。