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关键词： 膀胱癌   miR-145-5p   病理特征   E盒结合锌指蛋白2   N钙粘蛋白  

摘要： 目的:膀胱癌(BCa)是泌尿系统常见的肿瘤之一,其容易复发转移,致死率居高不下,一直困扰着临床医生。本文旨在研究miR-145-5p、ZEB2表达量与膀胱癌患者临床病理数据之间的关系;通过过表达/抑制miR-145-5p的方法,在膀胱癌T24细胞株中,探究miR-145-5p对T24细胞增殖、侵袭、迁移等生物学特性的影响,并初步探究miR-145-5p基于ZEB2及N-cadherin的调控机制。方法:收集2018年9月-2020年9月期间厦门大学附属第一医院膀胱癌患者术后癌及癌旁组织样本共34例,运用qRT-PCR方法检测miR-145-5p表达量,将检测数据和患者临床病理数据进行统计学分析,明确miR-145-5p表达量与临床病理数据的关系。筛选TCGA数据库中含有ZEB2表达量数据的膀胱癌患者,将ZEB2表达量与临床病理数据进行相关性分析,明确ZEB2表达量与临床病理数据的关系。通过细胞转染,在膀胱癌T24细胞株中过表达和抑制miR-145-5p,探究miR-145-5p对膀胱癌细胞生物学特性的影响,初步探究可能的作用机制。结果:1 qRT-PCR法测得癌及癌旁组织miR-145-5p表达量,显示miR-145-5p在膀胱癌组织中表达量低于癌旁组织,在浸润性癌中低于非浸润性癌(P<0.05),表达量与年龄、性别和肿瘤大小之间关系无统计学意义(P>0.05);其表达水平与膀胱癌的TNM分期及病理分级负相关(P<0.05);2TCGA数据库中膀胱癌患者组织ZEB2表达量与人种、TNM分期、病理分级及淋巴转移显著相关(P<0.05),且与TNM分期、病理分级正相关(P<0.05),与性别、年龄、远处转移及生存时间未有明显关联(P>0.05);年龄、肿瘤TNM分期、病理分级、ZEB2表达量高低与膀胱癌转移具相关性(P<0.05);3膀胱癌T24细胞株过表达miR-145-5p后,ZEB2表达降低,N-cadherin蛋白表达降低(P<0.05);CCK8实验显示过表达miR-145-5p的T24细胞增殖能力降低(P<0.05);划痕实验显示过表达miR-145-5p的T24细胞划痕愈合能力减弱(P<0.05);Transwell实验显示过表达miR-145-5p的T24细胞穿膜能力低于对照组(P<0.05)。结论:1膀胱癌组织中miR-145-5p表达水平低于癌旁组织;miR-145-5p表达量与临床病理数据关系密切,高表达miR-145-5p的膀胱癌倾向更好的病理分级;2膀胱癌组织ZEB2表达量与临床病理数据关系密切,高表达ZEB2的膀胱癌倾向于较差的病理分级;3过表达miR-145-5p降低了膀胱癌T24细胞株增殖、侵袭、迁移能力。miR-145-5p可作用于下游ZEB2影响N-cadherin,从而抑制膀胱癌EMT过程。

关键词： 半枝莲   大肠癌   肿瘤干细胞   生物学功能   Wnt/β-catenin  

摘要： 目的:研究半枝莲干预对大肠癌干细胞(Colorectal cancer stem cells,CR-CSCs)体内外生物学功能的影响,并从Wnt/β-catenin信号通路探讨其调控机制。方法:1.大肠癌干细胞的分离和鉴定:应用侧群(Side population,SP)细胞分选结合无血清悬浮培养法,从人源大肠癌细胞SW480和HCT116中分离、富集大肠癌干细胞,采用Western blot实验验证其干性标志物Nanog、OCT4和SOX2蛋白的表达。2.半枝莲体内干预对大肠癌干细胞瘤体生长的影响:构建大肠癌干细胞裸鼠皮下移植瘤模型,按初始瘤体体积随机分为生理盐水组(n=6)和半枝莲组(n=6),计算瘤体体积和重量以检测半枝莲对大肠癌干细胞瘤体生长的影响;计算裸鼠平均体重以评估半枝莲对体重的影响。3.半枝莲体外干预对大肠癌干细胞生物学功能的影响:用不同浓度半枝莲干预大肠癌干细胞24 h,(1)CCK-8检测半枝莲对大肠癌干细胞增殖的影响;(2)克隆球形成实验检测半枝莲对大肠癌干细胞自我更新的影响;(3)裸鼠致瘤性实验检测半枝莲对大肠癌干细胞致瘤性的影响;(4)划痕实验检测半枝莲对大肠癌干细胞迁移能力的影响。4.半枝莲体外干预对大肠癌干细胞干性标志物和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transformation,EMT)相关蛋白表达的影响:用不同浓度半枝莲干预大肠癌干细胞24 h,(1)采用Western blot实验检测干性标志物Nanog、OCT4和SOX2蛋白的表达以评估半枝莲对大肠癌干细胞干性的影响;(2)采用Western blot实验检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Twist1蛋白的表达以评估半枝莲对大肠癌干细胞EMT特性的影响。5.半枝莲体外干预对大肠癌干细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响:用不同浓度半枝莲干预大肠癌干细胞24 h,采用Western blot实验检测大肠癌干细胞Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白Wnt1、p-β-catenin、胞质β-catenin及核β-catenin表达的影响。结果:1.大肠癌干细胞的分离和鉴定:与亲本大肠癌细胞比较,富集的大肠癌干细胞中干性标志物Nanog、OCT4和SOX2蛋白的表达均明显增加(P<0.05)。2.半枝莲体内干预对大肠癌干细胞的瘤体生长的影响:与生理盐水组比较,半枝莲组裸鼠瘤体体积和重量明显变小(P<0.05),且对裸鼠体重无明显影响。3.半枝莲体外干预对大肠癌干细胞生物学功能的影响:(1)半枝莲明显抑制大肠癌干细胞的增殖(与0 mg/m L组比较,P<0.05);(2)半枝莲显著抑制大肠癌干细胞的自我更新能力,可见克隆球的数量明显减少(与0 mg/m L组比较,P<0.05);(3)半枝莲显著抑制大肠癌干细胞的致瘤性(与对照组比较,P<0.05);(4)半枝莲明显抑制大肠癌干细胞的迁移能力(与0 mg/m L组比较,P<0.05)。4.半枝莲体外干预对大肠癌干细胞干性标志物和EMT相关蛋白表达的影响:(1)半枝莲明显下调大肠癌干细胞中干性标志物Nanog、OCT4和SOX2蛋白的表达(与0mg/m L组比较,P<0.05);(2)半枝莲明显抑制EMT调控因子Twist1蛋白的表达,上调上皮标志物E-cadherin蛋白的表达,下调间质标志物N-cadherin、Vimentin蛋白的表达(与0 mg/m L组比较,P<0.05)。5.半枝莲体外干预对大肠癌干细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响:半枝莲可显著下调大肠癌干细胞中Wnt1蛋白的表达,促进β-catenin的磷酸化,并降低胞质β-catenin及核β-catenin蛋白的表达(与0 mg/m L组比较,P<0.05)。结论:半枝莲体内干预具有抑制大肠癌干细胞瘤体生长的作用,半枝莲体外干预具有抑制大肠癌干细胞增殖、自我更新、致瘤性和迁移的作用。通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活化可能是半枝莲调控大肠癌干细胞生物学功能的重要机制之一。

关键词： 鼻咽癌   CCNB1蛋白   细胞增殖   肿瘤迁移  

摘要： 目的:　　鼻咽癌在头颈部肿瘤中是极为常见的恶性肿瘤之一，因为鼻咽癌的病理类型大多数为未分化型，属于恶性程度很高的鳞状细胞癌，因此早期时很可能已经发生颈部淋巴结转移。鼻咽癌的原发部位是鼻咽部粘膜组织，位置较隐蔽，分化程度低，对放射治疗较为敏感。放射治疗仍是治疗鼻咽癌的主要手段，化疗、靶向、免疫以及手术为辅助手段。综合治疗可以极大地降低鼻咽癌的死亡率，但是长期的随诊发现现有治疗不能明显降低鼻咽癌的远处转移，并且无法降低复发率。鼻咽癌的分布呈现区域性，我国南部地区最多见，世界范围内东南亚地区较为常见。鼻咽癌的另一特征是家族聚集性。所以，研究和探索清楚鼻咽癌的发病机制，将有助于鼻咽癌治疗方式的优化，提高生存率和改善癌症患者的生存质量。　　通过公共基因芯片数据库(GEO)搜索有关鼻咽癌表达的数据，联合R语言分析鼻咽癌组织与正常鼻咽组织差异表达的基因;利用基因本体(GO)数据库和京都基因数据库与基因组百科全书（KEGG）通路数据库的数据，采用富集和功能注释的方法对差异表达基因进行分析，同时绘制出蛋白质的相互作用网络图，找出并分析存在的网络节点和关键基因簇。　　细胞周期蛋白B1(CCNB1)调控细胞周期，是启动有丝分裂的关键分子。肿瘤细胞即是对正常细胞失去调控导致的，因此CCNB1的表达量起着重要的作用。目前对于CCNB1在鼻咽癌中的表达及可能存在的作用机制国内外少有报道。本研究的目的是探索鼻咽癌组织中CCNB1的表达量，及其可能存在的对鼻咽癌细胞发生发展所起的的作用。　　方法:　　1.荧光显微镜下确认慢病毒介导质粒构建稳转鼻咽癌细胞成功，采用实时定量PCR法、免疫印迹法检测并对比鼻咽癌细胞及转染后细胞中CCNB1的表达量的差异，采用CCK8法检测并对比鼻咽癌细胞及沉默CCNB1后鼻咽癌细胞的增殖能力，Transwell、划痕实验检测迁移能力。　　2.采用免疫组化法分别检测在27例鼻咽癌组织和9例慢性鼻咽炎组织中CCNB1的表达量，卡方检验比较CCNB1在两者之间表达的差异。　　结果:　　1.沉默CCNB1的鼻咽癌细胞与鼻咽癌细胞的CCK8实验、Transwell实验、划痕实验提示CCNB1表达下调对鼻咽癌细胞的增殖、迁移能力能产生明显抑制作用。　　***1的蛋白表达主要见于细胞质，27例鼻咽癌组织和9例慢性鼻咽炎组织的CCNB1蛋白阳性表达率分别为7.4％、11.1％，两组差异不具有统计学意义(P＞0.05)。　　结论:　　1.在体外鼻咽癌细胞中沉默CCNB1的表达，能对鼻咽癌细胞增殖、迁移产生明显影响。　　2.在鼻咽癌组织CCNB1呈低表达，和慢性鼻咽炎组织中CCNB1的表达量无明显差异。

关键词： 慢性髓细胞白血病   DNA双链断裂   替代修复途径   FEN1  

摘要： 目的:慢性髓细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML)是一种骨髓增生性肿瘤,其特征是形成费城染色体并产生BCR-ABL融合蛋白,具有显著增强的酪氨酸激酶活性。伊马替尼(Imatinib,IM)作为临床上CML患者的一线药物治疗效果良好,但仍有25%以上的CML患者对IM耐药导致治疗失败,并且对于急变期的CML患者来说,IM的治疗效果不佳。长期以来,DNA损伤被认为是癌症发生的原因之一,不适当的DNA修复可能通过抑制肿瘤因子的失活或致癌基因的激活导致细胞的恶性转化。在CML患者中,BCR-ABL的表达使产生的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平增加从而导致DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs),而CML细胞更倾向利用异常修复途径(Altnative end-joining,Alt-EJ)来修复DSBs。文献报道片状核酸内切酶(Flap endonuclease 1,FEN1)作为Alt-EJ的候选蛋白在多种实体瘤中高表达,而FEN1在CML细胞中的表达情况尚未可知。因此本研究拟检测FEN1在CML细胞中的表达水平,探究靶向FEN1对CML细胞生物学效应的影响并验证FEN1是否参与Alt-EJ途径。方法:1.利用RT-q PCR和Western blot分别检测FEN1在CML细胞株和CML病人中的表达,Western blot检测FEN1的表达是否受BCR-ABL活性的影响。2.利用慢病毒对K562(IM敏感)和K562/G01(IM耐药)细胞中的FEN1进行稳定敲低,并通过相关实验检测其生物学效应的改变。3.利用Western blot和免疫荧光检测CML细胞中的γH2AX的含量,以反映CML中DSBs的情况;采用分层萃取和免疫印迹的方法分析在诱导DSBs的情况下,参与经典非同源末端连接(Classical Non Homologous End Joining,c-NHEJ)途径和Alt-EJ途径已知的经典蛋白以及FEN1蛋白的FⅠ-FⅣ层分布谱;采用基于线性质粒的细胞内修复实验来检测敲低FEN1后细胞对DSBs修复途径的影响,通过CO-IP实验来检测在DSBs修复中,FEN1与其它修复蛋白的互相结合情况。结果:1.首次观察到FEN1在CML细胞及CML初诊病人的骨髓标本中高表达,并发现FEN1的水平不受BCR-ABL的影响。2.与对照组相比,在K562和K562/G01细胞中敲低FEN1的表达会抑制细胞增殖和促进凋亡,联用NU7441和IM会增强此效应;敲低FEN1的表达导致CML细胞累积更多未修复的DSBs。***细胞具有更多的自发性DSBs产生以及CML细胞c-NHEJ中关键蛋白KU70和LIG4水平降低;提取未经Calicheamicin(Cali)或者经Cali处理的K562和K562/G01细胞F1到F4层蛋白,发现FEN1的变化谱与Alt-EJ途径中蛋白保持一致。通过线性质粒修复实验发现敲低FEN1的表达后Alt-EJ途径活性降低,说明FEN1参与了Alt-EJ途径;CO-IP和Western blot实验证明FEN1在参与DSBs时,是以LIG1/FEN1/PCNA结合的方式发挥作用。结论:我们首次报道了FEN1在CML中高表达并且验证了FEN1参与了Alt-EJ途径,抑制FEN1对IM敏感细胞和耐药细胞的CML治疗均有积极作用,FEN1可以作为CML治疗选择中有希望的靶点。

关键词： 牙髓再生   浓缩生长因子   根尖牙乳头细胞   牙周膜细胞   组织工程  

摘要： 牙髓根尖周病是一类炎症性疾病,致病原因多种多样,可由创伤、病原体感染等原因所导致。作为一种细菌感染性疾病,牙髓根尖周病的病理过程与细菌和宿主因素高度相关。牙龈卟啉单胞菌(***,P.g)及其毒力因子脂多糖(LPS)能够通过触发各种炎症反应对牙髓及根尖周骨组织造成严重破坏,是牙髓根尖周病的致病菌之一。对于患有牙髓根尖周病的年轻恒牙而言,由于其牙本质壁菲薄,易根折,且没有根尖止点,根管治疗常常具有挑战性,牙髓血运重建术成为首选治疗方案。 牙髓血运重建术是牙髓再生组织工程中特定的细胞归巢模型,其在临床操作中的关键步骤是诱导血凝块形成,即形成具有细胞支架和缓释生长因子作用的血凝块,以募集根尖周围组织中的干细胞,使其在血凝块中增殖并朝成牙本质向分化,从而促进功能性牙髓-牙本质复合体的再生。然而,大量研究表明,牙髓血运重建术后并非理想化地形成了牙髓及牙本质,而是形成了骨样钙化组织、牙骨质样硬组织及类似牙周膜的组织结构。对于这一现象的成因学者们持有不同的看法。一些学者认为,实现牙髓再生的首要前提是保证干细胞的种类和来源,遗传调控机制在间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的分化和细胞谱系定向中发挥作用,根尖牙乳头细胞(Stem cells from the apical papilla,SCAP)及牙髓干细胞(Dental pulp stem cells,DPSCs)主要分化为Odontoblasts,而牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)主要分化为成牙骨质细胞(Cementoblasts)及成骨细胞(Osteoblasts)。另一些学者认为,在诱导牙髓再生的过程中,感染的存在也可能会改变细胞的分化能力和模式。牙髓根尖周病作为一种细菌感染性疾病,其病理过程与细菌和宿主因素高度相关,其根管内常有革兰氏阴性厌氧菌及内毒素的定植。残存细菌生物膜可能会导致DSPP的表达下调,并促使在骨和牙骨质中广泛表达的骨涎蛋白BSP表达上调。此外,一项研究结果表明,经血运重建后新生的硬组织与原发性牙本质相比存在更多的BSP阳性细胞,进一步增加了这一观点的理论基础。对牙髓坏死的患牙行牙髓血运重建术,根尖周围组织中的SCAP和PDLCs均为可能的细胞来源,但目前尚缺乏在炎症微环境下这两种细胞生物学特性间的比较研究。 除了干细胞种类和细菌感染可能影响牙髓血运重建的结果外,合适的细胞支架结构和充足的生长因子也是促使牙髓/牙本质组织再生的关键。美国牙髓病学会(AAE)推荐使用第一、二代血小板浓缩物富血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP)及富血小板纤维蛋白(Platelet-rich fibrin,PRF)作为根管内容物,起到细胞支架并提供细胞生长因子的作用。作为第三代血小板浓缩物,浓缩生长因子(Concentrated growth factors,CGF)于2006年由Sacco等人首次发现。随着对牙髓再生研究的逐渐深入,在多项体内外研究中均证实了CGF相对于其他血小板浓缩物的优势。目前已有大量使用CGF血小板浓缩物代替血凝块进行牙髓血运重建的病例及部分荟萃分析报道,相比血凝块进行牙髓血运重建而言,使用血小板浓缩物能显著提高牙根延长、根管壁厚度增加和根尖孔闭合的发生率以及根尖周围组织炎症愈合的成功率。现如今临床上已逐渐将CGF运用于牙髓血运重建术中,但在局部炎症微环境中CGF对SCAP及PDLCs生物学特性的影响并不明确。针对这一现状,本课题拟通过体内外实验探讨CGF对PDLCs和SCAP的生物学特性的影响,旨在为牙髓血运重建术后形成骨样钙化组织、牙骨质样硬组织及类似牙周膜的纤维组织的成因提供潜在依据,并为CGF在牙髓再生的临床运用提供理论依据。 目的: 本研究拟探究CGF和*** LPS对PDLCs和SCAP生物学特性的影响。 方法: 分离培养PDLCs和SCAP;制备不同浓度的浓缩生长因子条件培养基(CGF-conditioned medium,CCM);通过CCK8、Transwell迁移实验、ALP染色及茜素红染色来探究不同浓度CCM对PDLCs和SCAP增殖、迁移和矿化能力的影响。确定CCM的最佳浓度后,加入P.g LPS处理细胞,通过q PCR、ELISA、Western blot、迁移实验、ALP染色、茜素红染色来评估CCM在炎症微环境下对细胞迁移、成牙/成骨向分化、促炎细胞因子、粘附分子和基质金属蛋白酶表达的影响。在裸鼠皮下移植置入CGF/PDLCs或CGF/SCAP细胞膜片复合体的牙本质基质,评价两种细胞单独或与CGF结合时促进牙髓再生的效果差异。 结果: 实验一:浓缩生长因子不同浓度对PD

关键词： 急性髓系白血病   HIF-1α   DNA甲基化   TET2  

摘要： 急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一类起源于骨髓造血细胞的难治愈且死亡率高的恶性克隆性疾病。有研究证实,骨髓低氧微环境增强白血病的复发能力与耐药性,且低氧微环境激活低氧诱导因子（Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）进而促进AML的发生发展。近年研究表明,低氧微环境可以通过影响表观遗传修饰调控肿瘤的发生与发展进程。先前的大量研究已证实,基因组DNA甲基化异常修饰是AML的标志性生物学特征。但迄今为止,在AML的发生与发展过程中低氧环境与表观遗传修饰协同作用机制的相关研究报道较少。为此,本研究旨在探索低氧诱导因子HIF-1α介导DNA甲基化修饰调控AML发生发展的机理,并为白血病治疗提供理论依据。我们首先利用TCGA癌症基因组图谱数据分析发现,HIF-1α在人AML中高表达。接下来我们选用原发性急性髓系白血病HL60和NB4细胞进行低氧（1%O2）条件培养,并检测细胞生物学行为。结果显示低氧环境下,HL60、NB4细胞内HIF-1α蛋白大量积累,并促进HL60、NB4细胞增殖,促进HL60细胞迁移,但NB4细胞迁移无显著变化。基于以上结果,我们推测低氧环境诱导的HIF-1α表达参与调控AML细胞生物学行为。为了证明上述推测,我们利用HIF-1α的特异性抑制剂棘霉素（Echinomycin）分别在低氧和常氧条件下抑制HIF-1α功能。结果显示HL60、NB4细胞增殖能力显著降低,HL60细胞迁移能力也明显降低,而HL60、NB4细胞凋亡无显著变化。以上结果进一步证明,低氧微环境促进HIF-1α累积从而调控HL60、NB4细胞增殖和HL60细胞迁移。为了进一步揭示HIF-1α调控细胞迁移的机制,我们运用生物信息学手段筛选分析发现AML中与细胞趋化、迁移相关且显著高表达的CXCR4。我们在低氧培养条件下检测CXCR4表达,结果显示在HL60细胞中CXCR4转录水平显著上调,NB4细胞中无显著变化。在HL60中敲低CXCR4后发现,细胞迁移能力被显著抑制。接下来,为了证明HIF-1α与CXCR4的相互作用,我们利用Ch IP-q PCR实验方法进行验证。结果表明HIF-1α直接结合于CXCR4启动子上。因此我们进一步推测,低氧微环境激活HIF-1α积累,并通过CXCR4表达上调,驱动HL60细胞迁移。有研究证明,HIF-1α通过与DNA去甲基化酶TET2基因启动子区低氧反应原件（HRE）结合进而增强其转录活性。因此,HIF-1α可能通过调控TET2进而使CXCR4基因启动子区发生低甲基化。为了验证上述可能性我们采用MSP方法在HL60和NB4细胞中验证CXCR4启动子区域DNA甲基化。结果表明,低氧培养条件下HL60细胞中CXCR4基因启动子区域DNA甲基化修饰下降。同时发现,低氧环境下DNA去甲基化酶TET2表达上调,使用Echinomycin抑制HIF-1α后表达下调,并且在低氧环境下敲减TET2使CXCR4启动子区域DNA甲基化上调。综所上述,我们的研究证明低氧激活HIF-1α表达,并通过上调TET2的表达继而降低CXCR4启动子DNA甲基化水平,进而促进HIF-1α与CXCR4启动子结合,从而增强HL60细胞迁移能力。

关键词： 课程思政   细胞生物学   思政元素   思政案例  

摘要： 课程思政是当前高等院校教育教学工作的新理念、新模式,是当今高等学校人才培养的重要任务,深入挖掘专业课的思政元素,才能使专业课程思政与思政课程同行,真正实现全方位育人的目标。

关键词： 皮脂腺细胞   细胞生物学   脂质合成   叉头框O1基因  

摘要： 目的：　　FOXO1对SZ95皮脂腺细胞增殖、分化、周期、凋亡和脂质合成的调控作用。　　方法：　　1.连续培养SZ95细胞，待融合度达30%、50%、70%、90%时，用qRT-PCR技术、蛋白印迹（WB）、免疫荧光和尼罗红染色观察FOXO1和成脂因子（PPAR和SREBP-1）表达、FOXO1定位、脂质水平。　　2.使用重组FOXO1（Ad/GFP-FOXO1）过表达腺病毒感染SZ95细胞或RNA干扰（si-FOXO1）FOXO1表达，MTS、流式细胞术、WB、尼罗红染色检测细胞增殖、周期、凋亡、脂质水平及成脂因子（PPAR、SREBP-1）、周期相关因子（p21、p27、p53）、凋亡相关因子（Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3）。　　结果：　　***95细胞分化过程中FOXO1表达　　SZ95细胞融合度达到30%、50%、70%和90%，qRT-PCR显示FOXO1mRNA表达逐渐增加，WB发现FOXO1、p-FOXO1和成脂因子PPAR蛋白水平逐步增强，而成脂因子SREBP-1变化无明显差异;免疫荧光实验显示FOXO1主要在胞核中表达;尼罗红染色发现脂质合成逐渐增多。　　***1过表达对SZ95细胞增殖、周期、凋亡和脂质合成的影响　　用Ad/GFP-FOXO1腺病毒转染SZ95细胞，WB显示FOXO1与FOXO1蛋白水平提高，而成脂因子PPAR水平降低，SREBP-1无明显差异;尼罗红实验发现脂质水平降低;MTS实验发现，细胞转染腺病毒后于24h、48h和72h细胞增殖抑制，并且WB检测出增殖抗原PCNA水平降低;流式细胞术检测发现，实验组G1期增加，S期降低，同时WB检测周期相关因子p53、p21和p27水平增加;凋亡实验提示实验组细胞凋亡增加，同时WB发现凋亡相关因子Bax、Caspase-3与Cleaved Caspase-3水平增加，Bcl-2水平降低。　　***1沉默对SZ95细胞增殖、周期、凋亡和脂质合成的影响　　用siRNA oligo干扰FOXO1表达观察细胞的情况。WB显示干扰FOXO1表达之后，p-FOXO1降低，成脂因子PPAR和SREBP-1水平升高;尼罗红结果显示脂质水平提高;MTS实验显示实验组在24h、48h、72h增生明显，同时WB证实增值抗原PCNA表达升高;细胞流式检测发现，细胞周期实验组G1期减少，G2/M期增多，WB显示p21、p27和p53蛋白水平均减少;凋亡实验表明实验组的凋亡率降低，同时WB显示凋亡相关因子Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3水平减少，Bcl-2水平增多。　　结论：　　***1表达随着SZ95细胞分化而增加。　　***1过表达抑制SZ95细胞增殖、脂质合成，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡;FOXO1沉默促进细胞增殖、脂质合成，加快细胞分裂间期，抑制细胞凋亡。　　***1参与调控SZ95细胞增殖、分化、周期、凋亡和脂质合成。

关键词： 柑橘   色泽   红光   褪绿   类胡萝卜素   转录调控   质体   瞬时转化  

摘要： 色泽是柑橘果实重要的品质特征。柑橘果实中丰富多彩的黄色,橙色和红色归因于果实中类胡萝卜素的大量积累。在柑橘果实中,存在众多果肉果皮不能同步成熟的现象,有些品种当果肉达到可食用的成熟度时,果皮不能完全转色,甚至果实达到完全成熟,果皮仍然不能正常褪绿,这严重影响了果实的上市期以及商品价值。我国的柑橘品种虽然众多,但是果实成熟期相对集中,大多数品种集中在11月份成熟,导致成熟期间市场销售压力较大。对于一些较早熟或特晚熟的柑橘品种上市时着色参差不齐,因而严重影响了消费者的购买欲望。本研究以滑皮金柑果实(Fortunella crassifolia Swingle)为实验材料,阐释了一种采用红光照射使柑橘外果皮均匀着色的方法,探究红光调控果实色泽形成机理。并且,本研究成功建立农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化体系,为多年生木本植物的遗传改良和基因功能研究创造新平台。主要研究结果如下:1.建立柑橘果实瞬时表达体系用于基因功能验证以及细胞生物学研究。融安金柑和滑皮金柑被选为农杆菌介导的柑橘瞬时转化的理想材料;与其他柑橘类果实相比金柑表现出更高的转化效率和更长的表达时间。使用不同的荧光报告基因瞬时转化果实,比如微丝(GFP-Lifeact),内质网(GFP-HDEL),高尔基体(GFP-ST和RFP-ST),质体(RFP-PT)和核(H2B-GB),用共聚焦显微镜和活细胞成像来研究它们在果实细胞内的定位和动态。进一步,在柑橘果实里瞬时超表达PSY,显著提高了柑橘果实中类胡萝卜素含量,表明瞬时表达体系也可以用来快速验证基因功能。2.红光促进叶绿素降解和类胡萝卜素积累,从而改善采后柑橘果实着色。以采后褪绿不均的滑皮金柑果实为材料,评估了红光、乙烯利以及红光结合乙烯利的使用对果实褪绿的影响,结果表明以上处理均显著促进了柑橘果实外果皮的褪绿。比较褪绿效果,红光优越于乙烯利的应用。红光显著促进了柑橘果实转色,伴随叶绿体向有色体转化,叶绿素的降解和类胡萝卜素的积累。当红光应用于其它果实类型,比如温州蜜柑、皇帝柑,甚至番茄果实,均可以促进果实转色,表明红光促进果实褪绿是普遍现象。3.挖掘响应红光促进果实转色的关键基因,并解析Fcr NAC22调控果实转色机理。在红光促进金柑果实褪绿转红的过程中,通过转录组数据挖掘到特异响应红光的转录因子Fcr NAC22,并和蓝光处理的果实做对比,发现Fcr NAC22仅在红光辐照过程中上调表达。亚细胞定位研究表明Fcr NAC22定位于细胞核,并在果实转色时期上升表达。超量Fcr NAC22转基因功能验证结果表明,Fcr NAC22促进烟草叶片褪绿转黄,加速番茄和柑橘果实转色,促进类胡萝卜素积累以及质体转化。在本源遗传转化柑橘愈伤中发现Fcr NAC22促进愈伤转黄,增加类胡萝卜素的合成;干扰Fcr NAC22的表达抑制了红光诱导的果实转色。双荧光素酶报告分析、酵母单杂(Y1H)以及凝胶阻滞迁移(EMSA)实验分析,Fcr NAC22可直接结合类胡萝卜素代谢途径LCYB1和BCH2的启动子,以及ABA合成通路上NCED5的启动子,并激活这些基因的转录表达,导致果实类胡萝卜素水平以及ABA含量提高。上述结果不仅为改善柑橘类果实着色提供了一种安全有效的方法,也在分子和细胞水平上从多个角度为调控柑橘色泽品质提供了理论基础。同时,柑橘果实瞬时表达体系的建立为果实细胞生物学及基因功能的研究提供了新视角。

关键词： 牙周膜干细胞   外泌体   牙周缺损   再生修复  

摘要： 目的:从健康及牙周炎状态下的牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)培养上清中提取外泌体,通过体外实验观察两组外泌体对牙周炎PDLSCs增殖及成骨分化的差异,初步研究外泌体对牙周组织缺损再生修复的影响。方法:(1)PDLSCs获取、培养及鉴定:通过酶消化法培养健康及炎症状态牙周膜原代细胞,对其进行常规培养传代;有限稀释法培养克隆健康及炎症状态PDLSCs(H-PDLSCs和P-PDLSCs),并进一步对两组细胞的克隆能力进行计算;采用流式细胞术鉴定H-PDLSCs和P-PDLSCs。(2)外泌体分离及鉴定:将第三代(P3)H-PDLSCs和P-PDLSCs用去除外泌体的血清培养基(Exo-FBS)培养48h并收集两组上清,通过超速离心分离两组外泌体并进行鉴定,方法包括:(1)透射电镜(TEM)、(2)蛋白免疫印迹(WB)、(3)纳米颗粒追踪分析(NTA)。(3)外泌体与细胞培养:将H-PDLSCs来源外泌体(H-Exo)和P-PDLSCs来源外泌体(P-Exo)分别导入P-PDLSCs,倒置荧光检测外泌体标记情况;以P-PDLSCs为对照研究,将H-Exo和P-Exo各自作用于P-PDLSCs,采用CCK-8及克隆形成检测外泌体对细胞增殖能力的影响;ALP及茜素红染色检测外泌体对细胞成骨能力的影响并用RT-PCR及WB进一步检测成骨相关基因及蛋白COL1、RUNX2及ALP的表达情况。结果:(1)通过酶消化法及有限稀释法培养H-PDLSCs和P-PDLSCs,细胞呈漩涡状生长,形态均为长梭形;流式细胞术结果显示两组细胞均高表达间充质干细胞表型;经克隆形成培养后两组克隆形成率分别为35.50%±1.32%及22.04%±1.45%,其差别具有统计学意义(P<0.05)。(2)采用超速离心法可提取到两组外泌体,并通过TEM、WB及NTA进一步验证提取物符合外泌体特征。(3)倒置荧光显微镜发现外泌体能进入细胞内,说明细胞具有与外泌体结合的能力;CCK-8检测可得外泌体导入组的细胞增殖能力高于对照组,其中加入H-Exo更为明显(P<0.05);细胞克隆形成结果与之相符;ALP及茜素红染色后得知H-Exo组成骨能力最强,P-Exo次之,对照组最低;RT-PCR检测成骨相关基因COL1、RUNX2及ALP的表达情况反映出对照组、P-Exo组及H-Exo组三组呈依次上升趋势(P<0.05),并通过WB进一步得到验证。结论:PDLSCs来源外泌体能够促进炎性牙周膜组织来源PDLSCs的增殖及成骨分化能力,其中H-Exo的促增殖分化能力优于P-Exo,表明PDLSCs来源外泌体能够以“无细胞”治疗方式参与牙周组织再生修复。