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关键词： MSH2   肝细胞癌   生物学功能   PI3K-AKT   EMT  

摘要： 背景与目的肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中均位居前列。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌的主要组织学类型,占所有原发性肝癌病例数的80%。目前在中国,肝切除术和肝移植术是HCC的最佳治疗方法,但是由于肝癌早诊率较低,大部分患者确诊时已至中晚期,此时无法使用上述治疗方法,导致我国肝癌患者预后较差,生存率很低。因此,本研究旨在发现新的肝癌生物标志物,为肝癌患者的早期诊断和免疫治疗提供靶点。本课题通过蛋白质芯片技术发现抗MSH2自身抗体在肝癌早期表达较高,接着在肝癌人群中评价了该抗体的诊断价值,以及通过免疫组织化学技术比较了MSH2蛋白在肝癌组织及癌旁组织中的表达情况,发现MSH2可能是肝癌的潜在生物标志物。MSH2(sapiens Mut S homolog 2)是错配修复家族的一员,是一种管家基因,在包含HCC的多种恶性肿瘤中发挥作用。为了进一步探讨MSH2在肝癌发生中的作用,本课题通过构建稳定低表达MSH2基因的肝癌细胞株,研究MSH2对肝癌细胞株生物学功能的影响;通过肿瘤异种移植模型实验构建小鼠肝癌发病模型,验证MSH2对裸鼠体内肿瘤生长的影响;最后通过蛋白质免疫印迹实验检测MSH2对相关通路标志物蛋白表达量变化的影响,进一步验证MSH2影响生物学功能的分子机制。方法1.根据已知的癌症驱动基因,定制蛋白质芯片,随后用于检测53例早期肝癌(TNM=1,2)血清和49例健康对照血清中各自身抗体的表达水平,筛选得到抗MSH2自身抗体。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测205例早期HCC(TNM=1,2)血清和205例健康对照血清中抗MSH2自身抗体的表达水平,并评价该抗体的诊断价值。2.应用免疫组织化学技术(IHC)检测MSH2蛋白在75例肝癌组织和75例癌旁组织中的表达情况;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测MSH2蛋白在正常肝细胞L-02和5种肝癌细胞株SNU-449、Hep3b、Hep G2、Hu H-7、SMMC-7721中的表达情况。3.构建MSH2干扰慢病毒载体并将其转染肝癌细胞,验证干扰效果。CCK-8实验和克隆形成实验检测MSH2对肝癌细胞体外增殖能力的影响;划痕实验和Transwell实验检测MSH2对肝癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响。4.利用肿瘤异种移植模型实验研究MSH2对裸鼠体内肿瘤生长的影响。5.蛋白质免疫印迹法检测低表达MSH2后PI3K-AKT信号通路相关标志物p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、Cyclin D1、CDK2的蛋白表达情况以及EMT相关标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的蛋白表达情况。结果1.通过蛋白质芯片筛选肿瘤相关抗原自身抗体,应用ELISA方法进一步验证。在蛋白质芯片筛选和ELISA验证结果中,抗MSH2自身抗体在早期HCC(TNM=1,2)血清中的阳性率分别为37.7%和32.2%,均高于健康对照组中的8.16%和10.2%,且差异有统计学意义。以受试者工作特性曲线下面积(AUC)评价抗MSH2自身抗体的诊断性能,抗MSH2自身抗体在蛋白质芯片筛选中的AUC为0.709,在ELISA验证中的AUC为0.672,说明抗MSH2自身抗体能够诊断早期HCC。当诊断AFP阴性早期HCC时,抗MSH2自身抗体在蛋白质芯片筛选中的AUC为0.759,在ELISA验证中的AUC为0.704,AUC值都增大,说明抗MSH2自身抗体对AFP阴性早期HCC的诊断价值更高。最后将抗MSH2自身抗体与AFP联合应用于早期HCC的诊断,其在蛋白质芯片筛选中的AUC为0.906,在ELISA验证中的AUC为0.897,均明显高于单独利用抗MSH2自身抗体或者AFP时的诊断性能。2.免疫组织化学结果显示MSH2蛋白在肝癌组织中阳性率为62.7%,高于癌旁组织(41.3%),差异具有统计学意义(p<0.0001)。以正常肝细胞株L-02为对照,通过Western blot检测发现MSH2蛋白在Hu H-7、SMMC-7721、Hep G2细胞株中相对高表达,在SNU-449、Hep3B肝癌细胞株中表达量相对较低。3.用LV-MSH2-RNAi慢病毒载体、LV-MSH2-CON慢病毒载体转染Hu H-7、SMMC-7721细胞,Western blot和q RT-PCR实验结果显示MSH2的蛋白表达量和m RNA表达量均显著降低,表明成功构建了稳定低表达MSH2的肝癌细胞株。4.低表达MSH2能够促进Hu H-7和SMMC-7721肝癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力,肿瘤异种移植模型实验表明低表达MSH2能够促进裸鼠体内肿瘤的生长。5.低表达MSH2后,p-PI3K、p-AKT、

关键词： 喉癌   LncRNA   AFAP1-AS1   生物学功能  

摘要： 目的:研究长链非编码RNA肌动蛋白纤维相关蛋白1反义RNA1(AFAP1-AS1)在喉癌(LC)组织中的表达情况,探讨AFAP1-AS1对人喉癌细胞系的增殖、侵袭、迁移、凋亡等细胞功能的影响。方法:按照纳入和排除标准将2020年6月-2020年12月在南昌大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科接受喉癌(LC)手术的29例喉癌(LC)患者纳入。收取喉癌组织标本及癌旁正常组织标本,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测喉癌组织及癌旁正常组织中AFAP1-AS1的表达,并结合患者的临床特征及病理学特征进行相关统计学分析。构建低表达AFAP1-AS1质粒,并与空白质粒分别转染至人喉癌细胞系TU212细胞,实验分为三组,即空白对照组、空载组及实验组(AFAP1-AS1低表达组)。转染完成后采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测三组细胞中AFAP1-AS1的表达量,验证转染效率,AFAP1-AS1表达量下调大于50%以上表明转染成功。分别利用细胞计数实验(CCK8)、平板克隆形成实验、Edu细胞染色实验检测三组TU212细胞系的细胞生长增殖能力;Transwell小室、划痕实验分别用于检测三组TU212细胞的侵袭及迁移能力;流式细胞术分别验证三组TU212细胞凋亡功能。统计学方法:选择χ2检验或Fisher精确检验在各个实验数据中的相关计数信息之间比较,如性别,年龄等。计量分析数据除特别需要加以明确注明外均将采用(x±s)中的公式函数来精确表示,在对计量数据模型进行分析处理的工作过程中,首先需要对每组中的计量分析数据都分别进行正态数据分布参数检验和方差齐性参数分析,多组间采用单因素方差分析,两组间的数据比较可以采用两样本的t检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1.利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR),我们发现相对于癌旁正常组织,喉癌组织中AFAP1-AS1的相对表达量明显上调,[(3.051±4.523)vs(1.±0.004),P<0.05],差异有统计学意义。以喉癌组织中的AFAP1-AS1相对表达量的平均值3.051为基础将其细化分为AFAP1-AS1高表达组和AFAP1-AS1低表达组,同时结合患者的临床病理特征(如T分期、临床分期等)进行统计学分析。2.构建低表达AFAP1-AS1质粒,并转染至3组TU212细胞后,利用q RT-RCR测定AFAP1-AS1的表达量,与空白对照组对比,转染空载组的细胞系中AFAP1-AS1的△CT值无明显增高(P>0.05),差异无统计学意义,与空白对照组分别对比,AFAP1-AS1 siRNA3组细胞系中AFAP1-AS1的△CT值更高(P值分别<0.05、<0.05、<0.05),差异具有统计学意义;与转染空载组分别对比AFAP1-AS1 siRNA3组细胞系中AFAP1-AS1的△CT值更高(P值分别<0.05,<0.05,<0.05),差异有统计学意义,表明AFAP1-AS1低表达质粒转染成功,并从AFAP1-AS1 siRNA3组中选择AFAP1-AS1低表达最好的一组即AFAP1-AS1 siRNA-2组继续进行下一步实验。3.低表达AFAP1-AS1抑制TU212细胞的增殖,细胞计数实验(cell counting kit-8,CCK-8)提示,相对空白对照组,转染空载组细胞生长能力无明显下降(P>0.05),差异无统计学意义,然而AFAP1-AS1 siRNA组,细胞生长能力明显减退(P<0.05),差异有统计学意义;Edu细胞染色实验提示,相对正常对照组,转染空载组细胞增殖能力无下降趋势(P>0.05),差异无统计学意义,然而AFAP1-AS1 siRNA组,细胞增殖能力明显减弱(P<0.01),差异有统计学意义;平板克隆实验提示,相对正常对照组,转染空载组细胞菌落数量无减少趋势(P>0.05),差异无统计学意义,然而AFAP1-AS1 siRNA组,细胞菌落数量明显减少(P<0.01),差异有统计学意义。4、低表达AFAP1-AS1抑制TU212细胞的侵袭,Transwell小室侵袭实验提示,相对空白对照组,转染空载组细胞侵袭能力无下降趋势(P>0.05),差异无统计学意义,然而AFAP1-AS1 siRNA组,细胞侵袭能力明显受到抑制(P<0.05),差异有统计学意义。5、低表达AFAP1-AS1抑制TU212细胞的迁移,划痕实验提示,24小时后相对空白对照组,转染空载组空白面积无增大趋势(P>0.05),差异无统计学意义,然而AFAP1-AS1 siRNA组,空白面积明显增大(P<0.05),差异有统计学意义,表明细胞迁移能力明显被抑制。6、低表达AFAP1-AS1促进TU212细胞的凋亡,流式细胞术提示,相对空白对照组,转染空载组细胞

关键词： 早产   生命早期   肺发育   单细胞转录组测序  

摘要： 研究背景: 呼吸系统作为人类胚胎发育最早的系统之一,其结构和功能的正常发育是维持生命体生命活动的基础,肺组织的发育依次经过了五个时期,分别是胚胎期、假腺管期、小管期、原始肺泡期及肺泡期,在这关键的五个时期中,无论宫内感染、药物因素、遗传因素或其他原因作用,均可显著影响肺的发育及肺功能的变化。因此,当各种原因所致胎儿早产时,可因胎龄不同而其肺发育处于不同时期,其相应的产后呼吸状态也可能有较大的不同。不仅如此,胎儿时期的肺发育异常,极其可能是造成成年后呼吸系统异常的基础。近年来,由于围产医学的进步,显著改变了早产儿呼吸系统疾病的表现形式和预后,早产儿肺发育异常不仅与支气管肺发育不良、新生儿呼吸窘迫综合征、新生儿持续性肺动脉高压有关,也被认为是儿童慢性肺部疾病如哮喘、喘息性疾病、反复肺部炎症发生的基础,因此进行早产后肺发育情况的探究也为相关疾病的机制研究提供研究基础。 研究目的: 使用小型巴马猪建立早产后发育模型,探究早产儿生命早期肺发育情况,为寻找早产儿呼吸系统疾病的防治措施提供研究基础。 材料和方法: 选择胎龄104天(GD104,gestational 104 days)的SPF级巴马猪系母猪进行剖宫产,在无药物、机械辅助通气等医疗干预下,选择仔猪生后0h、4d、9d、21d为采样时间点,使用石蜡切片HE染色观察,并利用单细胞转录组测序技术对肺组织进行单细胞测序分析 结果:经早产(GD104)剖宫产娩出后,仔猪在未经机械辅助通气、肺表面活性物质应用、激素应用等类似人类早产婴儿抢救复苏措施干预下,存活至4d、9d、21d,并与出生0h样本比较,早产猪生后肺长期呈类似人类支气管肺发育不良的表现;单细胞转录组进行细胞分群分析后显示生后免疫细胞占比随生后时间增加逐渐增加,同时肺泡上皮细胞、内皮细胞、间质干细胞在生后占比逐渐下降;对各个时间点样本进行差异基因功能GO注释及富集分析后结果提示随着日龄的增加,早产后肺的细胞成分、分子功能、生物过程均具有显著差异。 结论:早产后肺病理学结果显示肺组织结构存在进行性加重的异常表现,细胞生物学及分子生物学实验结果则揭示早产后可能存在对肺损伤、心血管疾病、免疫异常等相关疾病的易感基础。

摘要： New technology developments foster new biology. Beginning from the early observation of cells by Robert Hooke and Anton van Leeuwenhoek, who figured out how to use optical lenses to achieve high magnification, microscopy has made huge advancement and each single discovery in cell biology has been accompanied with the development of microscopy innovations. Recent advances in microscopy have reached a previously unachievable resolution and acquisition speed, allowing people study the heterogenous cellular phenotypes accurately and efficiently. However, not all questions can be addressed with the existing approaches. For example, what is the single molecule basis of translation, how single ribosome translates; can we combine imaging based technologies with other existing approaches like CRISPR to further speed up cell biology discoveries? All of these questions require further effort to develop suitable imaging based technologies to address and this is what I aim to do during my PhD. In Chapter 2 and Chapter3, I will introduce two newly developed imaging based technologies to address the above mentioned questions and together, these technologies provide new opportunities to further facilitate cell biology researches.

关键词： 钛种植体   表面改性   压电效应   水热反应   钛酸钡   四方相  

摘要： 背景 种植修复是牙列缺失和牙列缺损治疗的常规方法之一。自骨结合理论奠定至今,种植相关技术有了巨大进步。但种植体在广泛应用的同时,实际骨结合面积并未达到理想的预期。加速和改善骨结合过程并保持种植体与软、硬组织结合的长期稳定性,及减少并发症的出现一直是口腔种植修复的研究热点。种植体骨结合的形成受到多种因素影响,其中电微环境的存在发挥着重要的作用。 骨组织作为一种天然带电体,其生物电活动在骨的发育和骨折愈合中均起到了重要作用。种植体骨结合的实质是骨损伤修复的过程,因此利用电刺激促进成骨的特性加速和改善骨结合的研究显示了良好的应用前景。骨具有压电特性,而牙齿在咀嚼时会对种植体-骨界面提供间歇性的力刺激。如能将两者结合,通过力电效应实现种植体表面内源性电微环境的构建,来促进和改善骨结合就具有重要的研究意义。 现有压电材料中,四方相钛酸钡具有压电特性,且有着良好的生物相容性。将钛酸钡成份引入骨科植入物中已有很多研究,通过构建植入物周围的电微环境,显著促进了成骨效果。而在口腔种植领域,利用四方相钛酸钡改性钛表面来促进成骨的研究尚未见报道。因此,能否在钛表面构建电学性能可调的四方相钛酸钡涂层,研究四方相钛酸钡涂层是否能通过力电转换机制来促进颌骨骨髓间充质干细胞的增殖分化、促进种植体骨结合就具有重要的理论和应用价值。 目的 本研究拟通过阳极氧化和水热反应技术在钛表面构建四方相钛酸钡压电涂层,为探究力电效应在植体表面形成的内源性电微环境对骨结合的影响建立模型基础,进一步研究四方相钛酸钡涂层对颌骨骨髓间充质干细胞生物学性能的影响,期望能为种植体表面改性探索出一条新的思路和方法。 方法 1.钛表面制备无机纳米管,选择不同的钡盐通过水热反应转化成钛酸钡涂层,SEM和XRD表征表面形貌及物相; 2.调整电解液配方,在钛表面制备有机纳米管以优化纳米管管长,初步对水热参数进行优化; 3.设置极限条件,通过优化碱量、时间、钡离子浓度探索四方相钛酸钡合成条件; 4.调整二次水热反应参数,探索二次水热反应时间对钛表面钛酸钡涂层的形貌和压电性能的影响; 5.通过细胞培养、成骨成脂诱导分化和流式细胞技术完成人颌骨骨髓间充质干细胞的鉴定; 6.通过免疫荧光、扫描电镜和CCK-8检测观察各组钛酸钡涂层对HJBMMSCs细胞粘附、细胞形态和细胞活性的影响;施加周期性压力,观察各组钛酸钡涂层对HJBMMSCs细胞成骨分化的影响。 结果 1.在氢氟酸无机电解液中,通过阳极氧化形成的二氧化钛纳米管涂层进一步通过水热反应可以转化为钛酸钡涂层,且钡盐为氯化钡时表面形貌较均一,但受涂层厚度的限制,使用常规手段表征钛酸钡物相时存在困难; 2.在乙二醇有机电解液条件下,通过阳极氧化形成的纳米管管长较氢氟酸电解液条件下的长,但受管长影响涂层表面易形成不规则的“纳米草”结构,本研究创新性的通过高温蒸汽冲洗方法予以去除,实现表面均匀、无“纳米草”的纳米管结构; 3.有机纳米管涂层通过水热转化可以实现足够厚度的钛酸钡涂层,有利于钛酸钡物相的表征,但四方相钛酸钡涂层的构建需要特定的水热反应参数,否则易形成无压电效应的立方相钛酸钡涂层; 4.通过探索极限条件下水热反应参数,我们发现Ba2+极限浓度条件下进行二次水热反应,可以实现钛表面四方相钛酸钡涂层的制备,并对四方相钛酸钡转化的可能机制进行了阐述; 5.通过优化二次水热反应时间可调整涂层表面四方相钛酸钡颗粒大小,形成不同形貌的四方相钛酸钡涂层,从而完成钛表面具有不同压电性能的四方相钛酸钡涂层的构建; 6.本实验所用的HJBMMSCs,经鉴定,满足MSC特性; 7.四方相钛酸钡涂层的表面形貌会影响人颌骨骨髓间充质干细胞的生长,涂层表面大颗粒钛酸钡的存在对细胞在涂层表面生长存在负面效应,小颗粒组钛酸钡在体外压力条件下具备促成骨能力。 结论 通过阳极氧化复合两步水热反应技术,我们在钛表面构建了四方相钛酸钡涂层,涂层具有压电特性,其中小颗粒组具备接近于湿骨的压电性能、良好的生物相容性,在成骨分化测试中具备良好的促成骨能力。

关键词： 脂肪组织   脂肪来源干细胞   年龄   脂肪移植   创面修复  

摘要： 目的探究年龄因素对人脂肪来源干细胞(ADSCs)生物学特性的影响,比较不同年龄组人ADSCs的形态学、衰老特征、分化潜能、表面标志物表达、增殖能力方面的差异;以及不同年龄组人ADSCs对成纤维细胞增殖、迁移的影响。方法收集2020年1月至2020年12月就诊于联勤保障部队第九四〇医院烧伤整形外科,27例健康患者的脂肪组织,年龄0-60岁。按供体年龄分为6组,A组:0-9岁(4例)、B组:10-19岁(4例)、C组:20-29岁(5例)、D组:30-39岁(5例)、E组:40-49岁(5例)、F组:50-59岁(4例)。获取各组的ADSCs并培养,传代培养获得第3代ADSCs,应用相差显微镜检测其形态学特征,通过CCK-8法检测各组ADSCs的增殖能力,体外成脂、成骨诱导检测各组ADSCs的分化潜能,采用流式细胞仪检测各组ADSCs的表面标志物表达水平,通过qPCR检测各组HGF、PPAR-γ、typeⅢcollagen、DbX2的表达水平。收集2020年就诊于联勤保障部队第九四〇医院烧伤整形外科1例健康患者皮肤组织,获取成纤维细胞并培养,传代培养获得第2代成纤维细胞,制备不同年龄组ADSCs条件培养基(Adipose-derived stem cells-conditioned medium,ADSCs-CM),通过CCK-8法检测各组ADSCs-CM培养的成纤维细胞的增殖能力,细胞划痕法检测各组ADSCs-CM培养的成纤维细胞的迁移能力。使用SPSS22.0软件进行数据分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果所有年龄组细胞均呈典型梭形,低龄组细胞可见细胞核小,细胞形态均匀相似;高龄组细胞的细胞核较大,形态不均匀。ADSCs细胞增殖能力随年龄增长,逐渐降低。体外成脂分化诱导结果:随年龄增大,ADSCs分化成脂能力逐渐下降;体外成骨分化诱导结果:随年龄增大,ADSCs分化成骨能力逐渐下降。各组ADSCs的间充质干细胞阳性表面标志物CD29、CD73、CD90、CD105表达率均在93%以上;阴性表面标志物CD34、CD45表达率均在2%以下。PPARγ、HGF、typeⅢcollagen的表达水平均随年龄的增长而下降;Db X2的表达水平随年龄的增长而呈上升趋势。β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数随年龄的增长而上升,而A与B、C组间的差异无统计学意义,A组与D、E、F间的差异有统计学意义(P<0.05)。各组ADSCs-CM均可促进成纤维细胞的增殖,但各组间的差异无统计学意义;随着年龄的增加,ADSCs-CM促进成纤维细胞迁移的能力逐渐下降。结论人的ADSCs的增殖能力、多向分化能力及分泌多种促进成纤维细胞增殖和迁移的细胞因子的能力随着年龄的增长出现下降趋势,但ADSCs成脂分化能力从40岁后才出现明显下降,各年龄组ADSCs都可以促进成纤维细胞增殖和迁移。

关键词： SDF2L1   蛋白质组学   RPL14   鼻咽癌   生物学功能  

摘要： 研究背景和目的:鼻咽癌是一种来源于鼻咽上皮的恶性肿瘤,发病率在地理位置、种族之间有明显的差异。易出现颈部淋巴结转移。然而,目前鼻咽癌转移的分子发病机制尚未完全阐明。在全球范围内,每年约有8.7万例确诊的鼻咽癌患者,相较于其他癌症,鼻咽癌是一种全球罕见性疾病,然而其发病率在我国的广西,香港,广东等华南地区较高。随着放疗化疗技术的提高,鼻咽癌患者的总体预后得到显著改善。然而,仍有15%-30%的患者会因为远处转移而治疗失败,20%的患者在治疗后出现局部复发。因此,迫切需要更好地了解鼻咽癌转移的分子机制,并为深入了解鼻咽癌的发生、发展,研发治疗新靶点提供新思路。 本课题组前期研究首次发现:与鼻咽粘膜慢性炎组织及正常鼻咽上皮细胞相比,基质细胞衍生因子2样1(Stromal cell derived factor 2 like 1,SDF2L1)在鼻咽癌组织及细胞中表达下调。通过慢病毒介导的RNA干扰技术发现,在鼻咽癌细胞中沉默SDF2L1能促进鼻咽癌细胞的迁移和侵袭,并初步发现SDF2L1的下调参与调控细胞的上皮-间质转化机制。提示SDF2L1的表达下调可能是鼻咽癌发生侵袭、转移的重要分子标志物。然而,SDF2L1在鼻咽癌中的下游关键调控靶基因及分子机制仍未知。因此,本研究深入探讨SDF2L1过表达鼻咽癌细胞模型的蛋白质组学下游关键调控靶基因核糖体蛋白L14(Ribosomal Protein L14,RPL14)的确定及其在鼻咽癌中的生物学作用。 研究方法:1.通过数据非依赖采集(Data Independent Acquisition,DIA)蛋白质组学技术精确对比SDF2L1过表达及空载鼻咽癌细胞间的蛋白质表达,应用生物信息学分析确定RPL14是SDF2L1在鼻咽癌中的下游关键调控基因并用蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)及荧光实时定量PCR(Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)进行验证。2.应用q RT-PCR,WB及免疫组化技术检测与正常对照相比,RPL14在鼻咽癌细胞及组织中的表达水平及其与鼻咽癌的临床病理关系。3.通过慢病毒介导技术,构建RPL14过表达鼻咽癌细胞模型,用嘌呤霉素筛选成功构建的鼻咽癌细胞并通过q RT-PCR和WB技术确定RPL14过表达效果。4.运用平板克隆形成实验及CCK-8实验检测RPL14对鼻咽癌细胞生长、增殖的影响;应用流式细胞术检测RPL14对鼻咽癌细胞生长周期的影响。5.通过Transwell迁移实验,细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测RPL14对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响。6.通过蛋白免疫印迹技术检测RPL14对鼻咽癌上皮-间质转化进程的影响。 研究结果:1.最终得到730个差异表达蛋白质,其中在SDF2L1过表达鼻咽癌细胞中表达上调的蛋白质有296个,表达下调的有434个。经过一系列生物信息学分析最终确定RPL14为SDF2L1在鼻咽癌中的下游调控关键基因。q RT-PCR(1.021±0.240 VS 1.700±0.195,p=0.019)及WB验证结果显示过表达SDF2L1后RPL14的表达升高。***14在16例鼻咽粘膜慢性炎组织中的m RNA表达水平为1.4217(0.8318～2.4977)显著高于在鼻咽癌组织中的表达0.3295(0.1195～0.6343),p<0.001。在32例对照组织中,RPL14的阳性率为53.125%(17/32),显著高于86例鼻咽癌的阳性率31.395%(27/86),p=0.03。除此之外,免疫组织化学结果发现RPL14的表达主要分布于细胞质中,RPL14的表达与TNM分期中的T分期(p=0.005)及N分期(p=0.003)相关。此外,与正常鼻咽上皮细胞株NP69(1.002±0.067)相比,RPL14的m RNA表达水平在5-8F细胞(0.714±0.09,p=0.011)及HK1细胞(0.613±0.057,p=0.002)中显著降低。WB实验结果显示,与NP69细胞相比RPL14的表达在鼻咽癌细胞5-8F及HK1中较低。3.与空载对照组(LV-p GV)相比,RPL14的m RNA和蛋白质表达水平在实验组细胞(LV-RPL14)中的表达显著升高(p<0.001),提示成功构建RPL14过表达鼻咽癌细胞模型。4.平板克隆形成实验证实过表达RPL14后鼻咽癌细胞的克隆形成能力显著降低(55.667±4.509 vs 37.000±2.646;77.333±13.32 vs36.000±5.196,all p<0.05)。CCK-8试验揭示过表达RPL14的鼻咽癌细胞生长能力显著减弱(all p<0.

关键词： 非小细胞肺癌   细胞生物学   非编码小分子RNA-19a   细胞因子信号转导抑制蛋白3  

摘要： 目的：　　探究miR-19a靶向调节SOCS3（Suppressors Of CytokinesSignaling3细胞因子信号转导抑制蛋白3）激活JAK1-STAT3（Janus Kinase1-Signaling Transducers And Activators Transcription3Janus激酶信号转导与转录激活因子3)信号通路对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学特性影响。　　方法及材料：　　选用南华大学附属第二医院胸外科2019年1月至2019年6月外科手术切除的原发性非小细胞肺癌组织30例，并配对同一部位肺癌旁正常肺组织（距离病灶＞5cm,经病理切片及免疫组化证实无肿瘤细胞浸润）作对照，所取标本均由病理学证实为NSCLC。培养人非小细胞肺癌A549细胞株，取对数生长期细胞进行转染。根据转染物不同对试验细胞进行分组：H-miR-19a组（mimic-miRNA19a转染的A549细胞）;L-miR-19a组（inhibitor-miRNA19a转染A549细胞）;p-SOCS3组（L-miR-19a组A549细胞进行SOCS3激动剂处理）;Control组。细胞转染结束后，再次进行培养，时间为48h。通过qRt-PCR检测NSCLC组织及癌旁组中的miR-19a、SOCS3的表达，探究miR-19a和SOCS3与肺癌临床分期、肿瘤理分类及有无远处转移等临床特征的相关性。　　体外研究分析：通过qRt-PCR检测各组细胞中的miR-19a和SOCS3的表达确认转染的成功性;应用Western-blot（蛋白印迹试验）检测SOCS3、JAK1-STAT3、Bcl-2\Bax蛋白表达浓度。下一步应用MTT（四甲基鸟氮唑蓝）比色法检测各组细胞存活和生长情况;Annexin-Ⅴ/PI(流式细胞仪)检测各组细胞的凋亡率,通过划痕及Transwell实验分析各组细胞迁移、侵袭状况，　　结果：　　（1）qRt-PCR检测肺癌组织与肺癌旁正常肺组织中miR19a和SOCS3比较，非小细胞肺癌组织中miR-19a表达更高，两组数据比较p＜0.05差异具有统计学意义。而癌旁正常肺组织中SOCS3表达更高，两组数据比较p＜0.05差异具有统计学意义。　　（2）临床特点分析：SOCS3、miR-19a的表达在有无淋巴结转移、病理类型、临床TNM分期等方面差异明显，两组数据比较p＜0.05，具有统计学意义;SOCS3、miR-19a的表达在有无吸烟史、性别、年龄等方面差异无统计学意义（p＞0.05）。　　（3）通过qRt-PCR检测体外转染细胞中的miR-19a和SOCS3的表达，miR-19a的表达H-miR-19a组＞Control组＞L-miR-19a组＞p-SOCS3组;而SOCS3与其相反;两两比较p＜0.05，差异有统计学意义。与临床组织检测结果呈现出一致性，验证了细胞mi19a质粒转染的成功性，为下一步的研究做好了铺垫。　　（4）WB检测：JAK1及STAT3蛋白在A549细胞中具有一致性蛋白浓度，其中H-miR-19a最高，其次为Control、L-miR-19a，最低为p-SOCS3，两两比较p＜0.05。SOCS3蛋白浓度在p-SOCS3水平最高，其次为L-miR-19a、Control，最低为H-miR-19a，两两比较p＜0.05差异具有统计学意义。Bcl-1蛋白的表达与JAK1-STAT3表达趋势一致。Bax蛋白表达相反。　　（5）MTT检测细胞的存活和生长状态，48h，H-miR-19a组在OD570nm波长处的吸光值明显高于p-SOCS3组，其次为对照组和inhibitor处理组，两两比较p＜0.05，差异具有统计学意义。　　（6）Annexin-V/PI法测定非小细胞肺癌细胞凋亡率。各组细胞凋亡率：H-miR-19a组最低，其次为Control、L-miR-19a，最高为p-SOCS3组。两两比较p＜0.05，差异具有统计学意义。　　（7）Transwell和划痕实验结果显示，在12h和24h，pSOCS3组Transwell下室侵袭的A549细胞数最少，划痕试验的划痕愈合最慢，其次为L-miR-19a。Transwell下室侵袭细胞数，划痕试验的划痕愈合速度H-miR-19a大于Control组。H-miR19组为下室侵袭细胞数最多、划痕愈合速度最快组，数据比较p＜0.05，差异有统计学意义。　　结论：　　（1）淋巴结转移、肿瘤病理类型、临床TNM分期是影响非小细胞肺癌组织中miR-19a，SOCS3表达的重要因素。　　（2）miR-19a在人非小细胞肺癌中靶向调控SOCS3激活JAK1-STAT3通路中JAK1、STAT3蛋白表达，从而降低细胞凋亡，促进细胞的增殖、迁移和侵袭。

关键词： 人牙龈干细胞   自噬   凋亡   成骨分化  

摘要： 目的: 异体干细胞移植介导的组织再生是目前牙周炎治疗的趋势。但异体干细胞在分离、扩增、移植过程中及移植后面临的应激刺激,会导致细胞衰老、凋亡,造成移植后病损局部干细胞存活数目较少。自噬作为维持细胞稳态的重要应激反应机制,在细胞存活中发挥重要作用,并与干细胞分化、粘附以及免疫调节作用密切相关。因此,本研究的目的是探究炎症微环境下自噬对牙龈干细胞增殖、凋亡及成骨分化的影响,期望以自噬为靶点,寻找小分子药物对干细胞进行调节,提高移植干细胞的存活及组织再生能力,为干细胞介导的牙周组织再生提供基础研究证据。 方法: 1.收集无全身系统性疾病、无牙周病年轻患者(12-24岁)的完整、无龋坏的前磨牙或第三磨牙,用酶消化法分离培养人牙龈干细胞,流式细胞术进行干细胞表面标志物鉴定,并验证其成骨及成脂分化能力。采用10 ng/ml TNF-a体外模拟炎症微环境,CCK-8检测正常及炎症状态下干扰自噬后牙龈干细胞增殖能力的变化,探究自噬对牙龈干细胞增殖的影响。 2.利用Western Blot检测正常及炎症状态下干扰自噬后凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3和Caspase-8的表达,分析自噬对牙龈干细胞凋亡的影响。 3.正常及炎症状态下,采用茜素红染色检测干细胞的成骨分化能力,RT qPCR检测成骨相关基因mRNA的表达,分析自噬对牙龈干细胞成骨分化能力的影响。 结果: 1.酶消化法可成功分离得到人牙龈干细胞,表达干细胞表面标志物,并具有多向分化能力。正常及炎症微环境下,自噬激活剂雷帕霉素和抑制剂氯喹作用24h对牙龈干细胞的增殖能力无明显影响,但作用48h和72h可降低牙龈干细胞的增殖能力。氯喹阻断自噬小体与溶酶体结合,会使自噬小体在细胞质中累积,细胞形态随之发生明显改变。 2.10 ng/ml TNF-a体外模拟炎症微环境能诱导牙龈干细胞凋亡。正常及炎症状态下,干扰自噬对细胞凋亡的影响趋势基本相同,但干扰自噬的时间不同,对细胞凋亡的影响不同。自噬激活剂雷帕霉素作用24h可能会抑制细胞凋亡,自噬抑制剂氯喹作用24h可能会激活细胞凋亡,而两者作用48h后均可能激活细胞凋亡,作用72h后均可能抑制细胞凋亡。 3.正常状态下,自噬激活剂雷帕霉素和抑制剂氯喹作用于成骨诱导早期(72h)均可抑制牙龈干细胞的成骨分化能力,但雷帕霉素比氯喹的抑制作用更强。炎症状态下,牙龈干细胞成骨分化能力显著降低,而且雷帕霉素作用于成骨诱导早期可进一步抑制成骨,但氯喹作用于成骨诱导早期可提高牙龈干细胞的成骨分化能力。 结论: 短期激活或抑制自噬(24h)对牙龈干细胞的增殖能力无显著影响,但自噬激活或抑制48h及以上可能会降低牙龈干细胞的增殖能力。激活自噬24h可能会抑制牙龈干细胞凋亡,抑制自噬24h可能会促进细胞凋亡,但激活或抑制自噬48h均可能促进细胞凋亡,而激活或抑制自噬72h均可能抑制细胞凋亡。正常状态下,成骨诱导早期(72h)激活或抑制自噬均可抑制牙龈干细胞成骨分化能力,但激活自噬比抑制自噬的抑制作用更强。炎症状态下,牙龈干细胞成骨分化能力显著降低,而且成骨诱导早期激活自噬可进一步抑制成骨,但成骨诱导早期抑制自噬小体降解可提高成骨分化能力。

关键词： 羟基磷灰石   柠檬酸源碳点   模板   骨肉瘤  

摘要： 羟基磷灰石（HAp）是骨骼和牙齿的主要无机成分,在骨组织工程中被广泛应用。已有研究证实,小尺寸的纳米HAp能抑制多种肿瘤细胞的增殖,但制备粒径均匀且大小可控的纳米HAp一直是难点。常规方法制备的HAp往往存在粒径大小不可控等问题。模板法因模板剂含有官能团,具有空间限域作用,能实现对材料大小、形貌、结构等的控制,被广泛应用于纳米材料制备。碳点模板法制备HAp是近几年发展起来的新型制备方法。柠檬酸源碳点尺寸小（3～5 nm）,且球形碳核表面含有丰富的官能团,易于表面修饰改性,是理想的模板剂。目前关于柠檬酸源碳点的制备方法尚需完善,碳点的表面结构对模板作用的影响机制有待深入研究。谷氨酸具有促进生物矿化的能力。本文以柠檬酸碳点和谷氨酸修饰的柠檬酸碳点为模板制备纳米HAp,研究了碳点对HAp尺寸和结构的影响,并研究纳米HAp的细胞相容性及对骨肉瘤细胞的作用,研究结果及结论如下:（1）采用直接热解法制备了柠檬酸碳点和谷氨酸修饰碳点。实验结果表明:热解法制备的柠檬酸碳点和谷氨酸修饰碳点水溶性好,与水热法相比产量高;柠檬酸碳点的碳核为无定型碳核,平均颗粒尺寸为4.24±0.57 nm,其表面存在-COOH、–C=O和-OH等基团;谷氨酸修饰碳点的碳核部分结晶,颗粒尺寸相较柠檬酸碳点有所减小,平均尺寸为3.42±0.67 nm,研究表明随着谷氨酸与柠檬酸原料配比的升高,通过酰胺键接到碳点表面的的谷氨酸在一定范围内数量增加。（2）以柠檬酸碳点为模板水热法制备了不同粒径的纳米HAp。研究结果显示,水热温度为150℃,p H值为11.5是碳点模板法水热制备HAp较佳的反应条件。当柠檬酸碳点浓度≦2.0 mg/m L时,HAp的物相、基团和化学状态受模板影响较小,随着浓度升高,HAp的平均粒径先从71.33 nm增加至84.48 nm,再减短到67.74 nm,晶格常数a和c随柠檬酸碳点的升高也有类似的变化趋势;当柠檬酸碳点浓度≧2.0 mg/m L时,HAp尺寸下降、团聚加剧,结晶性低。细胞实验结果表明,柠檬酸碳点制备的纳米HAp不影响正常细胞的形态和增殖,但对骨肉瘤细胞（143b）具有抑制作用,与对照组的HAp相比,柠檬酸碳点制备的HAp对骨肉瘤细胞的抑制作用更强,在此尺寸范围内没有呈现明显的尺寸依赖的细胞毒性,最大抑制率只有20%。（3）以谷氨酸修饰碳点为模板水热法制备了不同粒径的纳米HAp。研究结果显示,修饰碳点的谷氨酸的量对HAp的尺寸影响小,随着谷氨酸量的增加,产物的结晶度下降,团聚加剧。与谷氨酸修饰量相比,谷氨酸修饰碳点浓度对纳米HAp的尺寸起决定性作用,随着谷氨酸修饰碳点浓度从0升高到2.0 mg/m L,平均粒径下降由71.33 nm下降到49.20 nm,表明谷氨酸修饰到碳点表面,有利于提高碳点的模板作用,但当碳点浓度≧1.5 mg/m L时,产物团聚加剧,结晶度稍有下降。谷氨酸修饰碳点的模板作用有利于CO32-取代了HAp中的PO43-形成B型碳酸根取代羟基磷灰石,晶格常数a和c减小。细胞实验结果表明,谷氨酸修饰碳点制备的纳米HAp不影响正常细胞的形态和增殖,与对照组的HAp相比谷氨酸修饰碳点模板制备的HAp对骨肉瘤细胞的抑制作用更强,出现了尺寸依赖的细胞毒性,其中平均长度为49.2 nm的样品抑制作用最强,最大抑制率超30%,展现出了良好的抗肿瘤活性。