关键词：
内皮祖细胞
长链非编码RNA
增殖
凋亡
迁移
成血管
血管新生
深静脉血栓形成
溶栓
治疗
高通量测序
双荧光素酶报告基因
RT-qPCR
靶点
通路
相关分析
临床价值
诊断
生物标志物
摘要：
静脉血栓栓塞症(Venous Thromboemlism,VTE)包括深静脉血栓形成(Deep Venous Thrombosis,DVT)和肺栓塞(Pulmonary emlism,PE),是世界上第三大最常见的、严重威胁患者生命的血管疾病,仅次于急性冠状动脉综合征和脑卒中。其发病率呈逐年增加的趋势,且随着年龄的增长而急剧增加。DVT可引起严重并发症血栓后综合征(Post-thrombotic syndrome,PTS)和致命性肺栓塞,导致患者死亡可能。DVT的治疗目的是预防肺栓塞和血栓扩散以及静脉血栓栓塞复发造成的不良后果。目前,急性DVT的常规治疗方法包括抗凝、溶栓、取栓、下腔静脉滤器植入等手段。快速溶栓可减少瓣膜损伤和静脉高压,减少长期并发症。抗凝为临床上DVT的标准治疗方法,但是抗凝只能减缓血栓的继续增大,不能加速已有血栓的溶解及消除已有的血栓,也不能降低PTS的发生率,而且会增加患者出血的风险。单纯抗凝治疗后仍约有20%-50%的DVT患者发展为PTS,出现患肢顽固性水肿、疼痛、沉重感、色素沉着甚至静脉性溃疡,严重影响了患者的生存和生活质量。此外,一部分DVT患者因延误诊断和治疗时机,治疗时已对临床中常规治疗方法的疗效不佳。因此,寻找DVT早期诊断、高效防治及改善预后的新方法、新手段在临床实践中具有重要的价值。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)是 Asahara 等人在 1 997 年从成人外周血中首次分离出来的一种多能细胞,它不但具有分化为成熟内皮细胞的特性,同时还具有分泌细胞因子和血管生长因子的作用,这在内皮修复和血管新生过程中发挥极其重要的作用。目前,随着EPCs功能研究的增多、机制研究的深入,其已经成为学者研究的热点,在再生医学中的地位越发显著。在血管组织工程和细胞疗法,特别是在血管疾病的治疗中,展现出巨大的潜在临床应用价值。骨髓来源的EPCs首先被释放到微循环中,因此,其在静脉中具有相对较高的含量,能够修复缺失或受损的内皮,促进新生血管的形成,进一步增强血栓部位的静脉重建。据此,EPCs可作为DVT生物治疗方法中具有前景的潜在种子细胞。越来越多的研究表明,EPCs被募集到血栓部位,通过分泌血管生长因子、细胞因子等因子加速血栓的溶解和再通,并且其在成人的生理和病理血管新生过程中也发挥重要的调控作用。此外,EPCs具有通过分化为内皮细胞而增殖、迁移和形成新生血管的能力,并且最近在目前治疗方案中治疗效果不佳的患者中,已成为DVT相关疾病中一种有前景的治疗方法。尽管EPCs展现出了其潜在的治疗价值,但其临床应用仍面临许多挑战。循环EPC的数量和功能会受到微环境中不利条件的影响,例如吸烟、高龄、糖尿病、心血管危险因素、缺血性疾病和移植血管病变等。因此,开发改善EPCs募集至血栓部位并增强其血管新生能力的方法对EPCs用于DVT的治疗具有尤为关键的作用。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)属于一类具有200个核苷酸以上的非编码RNA,主要通过表观遗传修饰以及转录和翻译调控等多种方式发挥作用。研究发现,lncRNA可以作为miRNA的竞争者或海绵分子来间接调节基因表达,目前其已成为血管生成、发育、分化、代谢和自噬等过程中的重要调节因子。此外,很多lncRNAs在包括血管疾病在内的多种疾病中表达失衡,进而参与调控疾病的进展,并可做为疾病诊断和预后的潜在靶点和生物学标志物,为治疗血管疾病新方法的研发提供新的思路和方向,具有很大的应用前景,然而,目前lncRNAs在静脉血栓溶解和再通中的作用尚不清楚。在本课题组之前的研究中,通过lncRNA芯片检测DVT患者及健康人EPCs中lncRNA的差异表达,结果显示,与健康对照组相比,DVT患者的EPCs中lncRNA GUSBP5-AS(enst00000511042)的表达明显上调,但其作用并不清楚,我们猜测GUSBP5-AS可能参与调节EPCs的血管生成并参与静脉血栓的溶解和再通。因此,本实验重点研究lncRNA GUSBP5-AS对EPCs生物学功能、DVT溶解和再通的作用,并探讨其潜在的分子机制。这些发现可能有助于开发一种安全有效的治疗DVT的新方法。本研究分为四部分进行论述,以下分别是目的、方法、结果和结论。第一部分:LncRNAGUSBP5-AS对内皮祖细胞生物学功能的影响目的:明确lncRNA GUSBP5-AS对人内皮祖细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和体外成血管功能的调控作用。方法:1.密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞,使用EGM-2 MV培养基诱导、培养并扩增EPCs。流式细胞术以及Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色对内皮祖细胞进行鉴定,合成lncRNAGUSB
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