教学课程资源库 更多>>

关键词： IGF2BP3   食管鳞癌   siRNA   ECA109  

摘要： 目的研究IGF2BP3蛋白在食管鳞癌(ESCC)患者临床病理特征间的关系;脂质体介导的IGF2BP3-siRNA对ECA109细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法应用组织芯片和免疫组化验证IGF2BP3在122例ESCC患者组织中的表达,分析与患者临床病理特征的关系;通过介导IGF2BP3-siRNA转染ECA109食管鳞癌细胞系,根据绿色荧光蛋白验证在细胞中的转染结果;免疫蛋白印迹法检测IGF2BP3蛋白的表达;分别使用划痕实验、CCK-8、Transwell实验证实在ESCC细胞的迁移、增殖、侵袭的能力。结果IGF2BP3在食管鳞癌中的蛋白表达与远处转移、淋巴结转移、TNM分期显著相关(P<0.05),使用脂质体将IGF2BP3-siRNA转染进入ECA109细胞,转染效率可达83.41%,Western blotting结果显示转染的IGF2BP3-siRNA能够明显减少IGF2BP3表达。划痕实验结果显示IGF2BP3-siRNA组细胞迁移距离(137±8.2μm)与NC组(198.4±25.6μm)和CON组(228.6±22.5)相比较明显降低(P<0.05),IGF2BP3蛋白表达量降低能够明显降低食管癌细胞的迁移能力;CCK-8实验在转染后48小时实验组的生长抑制率最高为:46.17±0.01%,能够显著降低细胞增殖能力(P﹤0.05);通过Transwell实验检测细胞侵袭率:空白对照组和阴性对照组的侵袭细胞个数明显高于实验组(84±10.79),IGF2BP3-siRNA能够降低ECA109肿瘤细胞侵袭率(P﹤0.05)。结论ESCC患者在临床进展中可能会因为IGF2BP3的表达改变导致不同的临床结局,在食管鳞癌组织中IGF2BP3蛋白质的表达与临床病理资料关联密切,在体外实验中IGF2BP3表达降低能抑制ECA109细胞增殖、迁移及侵袭能力,其具体机制有待我们下一步实验验证。为IGF2BP3在食管鳞癌的临床运用中打下一定基础。

关键词： KIF15   miR-578   乳腺癌   增殖   侵袭   迁移  

摘要： 目的乳腺癌具有很强的侵袭性和转移性,是全球女性癌症相关死亡的主要原因。虽然外科手术、化学疗法、内分泌治疗、靶向治疗和放射疗法的显著进步有助于原发性肿瘤的根除,但高复发率和耐药性严重影响了乳腺癌患者的预后。因此,探索乳腺癌发生发展的分子机制,筛选新的有效治疗靶点及预后标志物,对于提高乳腺癌患者的治疗效果和生存率具有重要的现实意义。驱动蛋白KIF15,又称为Hklp2,为驱动蛋白超家族成员之一,主要参与细胞内有丝分裂、减数分裂和大分子的运输,在肿瘤耐药性中起到重要作用。KIF15的异常表达可能会引起细胞内遗传物质分布异常从而导致肿瘤的发生发展。我们前期研究发现KIF15在乳腺癌组织内高表达并与预后密切相关,这提示KIF15可能是乳腺癌发生发展中的重要因子。因此,KIF15或许能成为乳腺癌未来靶向治疗的有效潜在靶点。microRNA(miRNA)是一类单链、内源性非编码RNA,通过与靶基因mRNA3’端非翻译区(3'-UTR)的靶序列互补配对结合,导致mRNA降解或翻译抑制,调控基因转录过程。研究表明多种miRNAs参与乳腺癌的发生、发展以及侵袭。本研究通过对乳腺癌及癌旁组织中KIF15表达的检测,分析其与乳腺癌患者临床病理特征的关联性。运用生物信息学和体外实验初步探索上游miRNA靶向KIF15对乳腺癌细胞生物学的影响。通过体外和体内实验,研究KIF15下调后对乳腺癌细胞增殖、迁移的影响,在一定程度上阐明KIF15调控乳腺癌细胞增殖迁移的分子机制,明确其在乳腺癌的发生、发展中的具体意义,靶向KIF15可能是乳腺癌治疗的有效策略。方法1、KIF15在乳腺癌组织中的表达及临床意义:采用RT-qPCR、免疫组化对55例乳腺癌组织及其对应的癌旁组织中KIF15mRNA和蛋白的表达进行检测,分析KIF15表达与乳腺癌患者临床病理特征的相关性。Kaplan-Meier整体生存分析探究KIF15表达与乳腺癌预后的关系。2、KIF15上游调控miRNA的预测验证及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响:应用Targetscan和miRDB数据库预测靶向KIF15的miRNAs,双荧光素酶报告基因实验初步筛选验证miRNA及结合位点。miR-578靶向抑制KIF15的作用最明显,CCK-8、平板克隆及Transwell实验检测miR-578靶向KIF15对乳腺癌细胞增殖、迁移能力的影响。3、KIF15下调对乳腺癌细胞生物学行为的影响:RT-qPCR和Western blotting检测siRNA转染后乳腺癌细胞中KIF15的表达水平。CCK-8、EdU细胞增殖、软琼脂细胞克隆、平板克隆及Transwell等体外实验检测KIF15下调后乳腺癌细胞的增殖和迁移能力。Western blotting 检测 KIF15 下调后 AKT、p-AKT、JNK、p-JNK、p53、PTEN、Cyclin D1、p21及Cleaved-Caspase3等功能蛋白表达变化情况。构建裸鼠皮下成瘤模型和小鼠肺肿瘤模型,观察分析KIF15下调后乳腺癌细胞皮下成瘤能力和肺部肿瘤形成能力。结果1、KIF15在乳腺癌组织中的表达及临床意义:乳腺癌组织中KIF15 mRNA和蛋白的表达较癌旁组织明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)。KIF15表达与肿瘤大小(P=0.009)、淋巴结转移(P=0.046)和TNM分期(P=0.005)有显著相关性,而与年龄、Her-2、ER和PR状态无相关性(P>0.05)。Kaplan-Meier整体生存分析显示,乳腺癌组织中KIF15表达越高,乳腺癌患者预后越差。2、KIF15上游调控miRNA的预测验证及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响:生物信息学分析筛选出靶向KIF15的前10个候选miRNAs,RT-qPCR和WB发现miR-578 mimics 转染 MDA-MB-231 细胞后 KIF15 mRNA 和蛋 白的表达抑制最明显。双荧光素酶报告基因证实miR-578与KIF15-3'UTR的特定位点结合从而抑制KIF15的表达。KIF15蛋白表达量随着miR-578转染剂量增加而降低。CCK-8细胞增殖实验显示miR-578 mimics 显著抑制 MDA-MB-435S、MCF7 和 MDA-MB-231 细胞的增殖能力。平板克隆实验发现 miR-578 mimics 抑制 MDA-MB-435S、MCF7 和 MDA-MB-231 细胞的集落形成能力。Transwell细胞迁移实验显示miR-578 mimics抑制MDA-MB-435S、MCF7和MDA-MB-231细胞的迁移能力。3、KIF15下调对乳腺癌细胞生物学行为的影响:成功设计si-KIF15序列,Western blotting 和 RT-qPCR 证实转染 siRNA 后

关键词： 上皮性卵巢癌   RIPK4   上皮间充质化  

摘要： 研究背景:上皮性卵巢癌是最常见的卵巢癌类型。而大部分上皮性卵巢癌患者临床诊断为进展期导致卵巢癌患者总体生存表现较差。对于进展期卵巢癌,肿瘤细胞减灭手术结合以铂类为基础的辅助化疗是目前主要的治疗方案。近年来,抗血管生成药物以及PARP抑制剂在被推荐应用于进展期卵巢癌化疗的维持治疗,但是患者的总体生存情况并未有显著改善。有70%左右的进展期患者因为癌症复发转移而治疗失败。因此需要积极寻找新的治疗靶点,改善患者预后。研究方法:高通量基因测序是筛查治疗肿瘤的基因靶点的有效方法,而基于基因测序数据所建立的各个数据库,则为我们寻找新的卵巢癌基因治疗靶点提供了很好的平台。我们首先采用GEO数据库和GEPIA数据库筛选出在卵巢癌组织中显著高表达且与卵巢癌患者预后相关的目标基因,并继续采用TCGA、Oncomine、KM plotter数据库进一步明确目标基因在上皮性卵巢癌中的临床意义。接下来,我们采用常用的人卵巢癌细胞系SKOV3,通过siRNA基因沉默实验建立目标基因低表达的卵巢癌细胞模型,检测RIPK4基因沉默对于细胞生长、凋亡、转移与侵袭肿瘤血管拟态形成的影响,同时探索RIPK4基因沉默对上皮间充质化(EMT)的影响。研究结果:通过生信分析,我们最终确定RIPK4作为我们的研究目标。生信分析结果显示:与正常卵巢组织相比,RIPK4在卵巢癌组织中表达显著增高。且在卵巢癌各种组织亚型中,包括浆液性、粘液性以及透明细胞性,RIPK4的表达均显著增高;Kaplan-Meier曲线生存分析结果提示RIPK4高表达会显著降低进展期卵巢癌患者的总体生存期(OS)和疾病进展后生存期(PPS),而多因素生存分析的结果则提示RIPK4高表达显著增加进展期卵巢癌患者的死亡风险(HR 1.473;95%CI 1.089-1.991;p=0.012);此外,RIPK4表达与患者的临床分期相关(P=0.017),且RIPK4高表达患者的比例随着临床分期的增高而增大。基础实验研究发现:RIPK4基因沉默显著抑制癌细胞体外转移与侵袭、生长和血管拟态行为,但对凋亡无明显影响,同时抑制癌细胞在裸鼠腹腔发生种植植性生长。此外,抑制RIPK4的表达会导致E—钙粘蛋白的(E-cadherin)表达增高和N—钙粘蛋白(N-cadherin)表达降低,从而来抑制癌细胞上皮间充质化(EMT)的进程。EMT是上皮来源的癌细胞获得转移侵袭能力的重要生物学过程。因此RIPK4可以通过调节E-cadherin和N-cadherin的表达来诱导卵巢癌细胞EMT进程,进而改变癌细胞转移和侵袭的能力。研究结论:我们首次探索并解释了 RIPK4在上皮性卵巢癌中的临床意义:与正常卵巢组织相比,RIPK4不仅在卵巢癌各种组织亚型中表达增高,且RIPK4的表达水平与上皮性卵巢癌患者的临床分期相关;此外,RIPK4高表达导致患者预后不良。此外,我们还首次探讨了 RIPK4与卵巢癌细胞上皮间充质化进程的关联,发现RIPK4可以通过负性调控E-cadherin和正性调控N-cadherin的表达诱导癌细胞发生上皮间充质转化,从而改变其转移和侵袭能力。鉴于以上结果,RIPK4可以考虑作为卵巢癌潜在的治疗靶点。

关键词： miR-15a/16-1   miR-16-1   CD4   NKG2D   T细胞   结直肠癌  

摘要： miR-1 5a/16-1基因复合体位于人13q14区域的DLEU2基因内含子内,其主要通过特异性结合多个靶基因发挥抑制肿瘤以及免疫调节的作用,miR-15a/16-1在多种类型的肿瘤疾病中处于较低水平,是一种公认的抑癌基因。NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞是一类具有免疫调节功能的细胞,其主要通过分泌TGF-β1进而抑制树突状细胞、NK细胞、和CD8+T细胞发挥免疫负调控效应。课题组前期通过模拟肿瘤微环境发现,经CD3抗体、CD3抗体+sRAE-1体外刺激后,野生型(WT)小鼠脾脏CD4+T细胞表面NKG2D的表达显著增加,同时发现miR-16-1的表达水平呈不同程度的下降趋势,并且通过CD3抗体、IL-2、IL-21、IL-15、IL-4等细胞因子模拟炎症微环境后也发现了同样的现象,初步明确miR-16-1与CD4+T细胞表面NKG2D呈负相关。此外,课题组前期引进了 miR-15a/16-1基因敲除(KO)小鼠,对该小鼠免疫功能进行初步分析发现,相较于WT小鼠,KO小鼠脾脏中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率显著增加,同时生物信息学分析显示NKG2D 3'-UTR存在miR-16-1的特异性结合区域,提示miR-16-1可能通过调控CD4+T细胞NKG2D的表达影响其功能。为了深入探讨CD4+T细胞中NKG2D表达的调控机制,以及该调控方式下是否影响CD4+NKG2D+T细胞的生物学功能,本研究拟通过流式细胞术(FCM)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、双荧光素酶报告基因实验进一步证实miR-16-1是否可以特异性结合NKG2D的3'-UTR。以WT、TG、KO小鼠荷瘤模型及临床肿瘤患者样本资料为研究对象,探讨miR-15a/16-1对CD4+NKG2D+T细胞生物学活性的影响及其在结肠癌进展中的作用。研究内容分为两个部分:研究内容一:miR-15a/16-1对CD4+T细胞NKG2D表达的影响目的:分析miR-15a/16-1是否影响CD4+T细胞NKG2D的表达及其分子机制。方法:(1)应用FCM检测生理状态下KO小鼠脾脏中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率以及CD4+T细胞表面CD25,CD44,CD69,CD28活化分子的表达。(2)应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-16-1是否可以特异性结合NKG2D 3'-UTR。(3)构建miR-15a/16-1转基因(TG)小鼠;应用PCR、FCM对TG小鼠进行常规鉴定;应用RT-qPCR检测TG小鼠组织miR-16-1的表达水平;应用RT-qPCR检测生理状态下KO小鼠、TG小鼠脾脏CD4+T细胞中miR-16-1与NKG2D mRNA水平;FCM检测生理状态下TG小鼠脾脏中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率以及CD4+T细胞表面CD25,CD44,CD69,CD28活化分子的检测;通过CD3抗体、CD3抗体+sRAE-1体外诱导TG小鼠脾脏中NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞的产生,FCM检测该群细胞的频率以及CD25,CD44,CD69,CD28活化分子的变化。结果:(1)与WT小鼠相比,生理状态下KO小鼠脾脏NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率显著增加;与WT小鼠相比,KO小鼠CD4+T细胞表面CD28、CD25的表达无明显变化,而CD44、CD69的表达显著升高。(2)共转染pGL3-NKG2D-WT、pRL-TK(海肾内参质粒)和miR-16-1模拟物后,293T细胞中萤火虫荧光/海肾荧光比值显著低于对照组,而转染pGL3-NKG2D-MUT的293T细胞中该比值无明显变化,结果证实miR16-1直接特异性结合NKG2D 3'-UTR,抑制CD4+T细胞NKG2D表达。(3)与WT小鼠相比,TG小鼠PCR可以扩增出特异性的条带且鼠尾外周血GFP阳性率显著升高;TG小鼠组织miR-16-1的表达水平较WT小鼠明显上调;NKG2D mRNA水平在TG小鼠脾脏CD4+T细胞中显著下调,而其水平在KO小鼠中上调;生理状态下TG小鼠脾脏NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率无明显变化且CD4+T细胞表面活化分子CD25,CD44,CD69,CD28均无明显变化;与WT小鼠相比,经CD3抗体、CD3抗体+sRAE-1活化后,TG小鼠脾脏NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的诱生能力下降,同时相应的活化分子CD25,CD44,CD69,CD28无明显变化,提示miR-16-1通过特异性结合NKG2D 3'-UTR参与NKG2D的表达。结论:miR-16-1可特异性结合NKG2D 3'-UTR,抑制CD4+T细胞NKG2D的表达。研究内容二:miR-15a/16-1对CD4+NKG2D+T细胞的功能影响及其在结

关键词： 肝细胞性肝癌   微小核糖核酸-557   临床病理   预后分析   细胞生物学  

摘要： 背景：　　肝癌是国内外严重威胁人类健康的主要癌症之一，其发病率和死亡率在全球所有恶性肿瘤中排第六和第四，其中肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）占原发性肝癌的75%-85%，世界范围内每年可致75万患者死亡。HCC的发病率具有较大的地域异质性，大约有85%的HCC发生在发展中国家和欠发达地区，而其中有50%发生在中国。早期肝癌预后较好，但多数患者在首诊时已处于进展期，而这部分患者的发病率和死亡率比值接近100%。尽管近些年来HCC的治疗取得了一定的进展，但高复发率和高转移率使其预后仍不理想。因此，研究HCC的诱发因素及影响HCC侵袭和转移的过程，进而寻找肝癌的预后生物标记物及潜在治疗靶标是当下重要研究领域。　　第一部分：miR-557在HCC中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系　　目的：探讨miR-557在肝癌中的表达水平及其与患者临床病理特征及预后的关系。　　方法：　　1、生物信息学分析miR-557在HCC瘤组织中的表达。　　2、运用实时荧光定量PCR（Real Time Quantitative PCR,RT-qPCR）检测肝癌组织及对应癌旁非瘤组织中miR-557的表达水平。　　3、分析miR-557表达水平与HCC患者临床病理参数及生存之间的关系。　　4、运用RT-qPCR检测HCC细胞株和人正常肝细胞L02中miR-557的表达水平。　　结果：　　1、生物信息学分析GSE108724数据集发现，与癌旁非肿瘤组织相比，miR-557在HCC中低表达;分析GSE26323数据集发现，与原位HCC相比，肺转移性HCC中miR-557表达水平更低。　　2、miR-557在HCC瘤组织中的表达水平显著低于配对的癌旁非瘤组织。　　3、34例HCC组织标本中，miR-557在低分化患者中的表达水平低于中高分化患者，在＞5cm的HCC患者中的表达水平低于≤5cm的HCC患者，在TNMⅢ/Ⅳ的HCC患者中的表达水平低于Ⅰ/Ⅱ期HCC的患者，在低分化的HCC患者中的表达水平低于高中分化的HCC患者;miR-557低表达的HCC患者的总生存时间更短。　　4、相比正常肝细胞L02，miR-557在肝癌细胞株MHCC-97H、MHCC-97L、Huh7、HepG2、SMMC-7721中表达均下调，其中MHCC-97H细胞表达最低，Huh7细胞表达最高。　　结论：　　miR-557在肝癌组织及细胞系中均呈低表达，且与患者恶性生物学特征及不良的预后显著相关。　　第二部分：探讨miR-557对肝癌细胞体内外生物学行为的影响　　目的：　　探讨干扰或促进miR-557的表达是否影响肝癌细胞的生物学行为。　　方法：　　1、在体外运用miR-557mimics/mimic-NC或慢病毒Lv-miR-557/Lv-vector转染MHCC-97H细胞，运用inhibitors/inhibitor-NC或Lv-sponge-miR-557/Lv-sponge-NC转染Huh7细胞，并用RT-qPCR验证转染效率。　　2、CCK-8实验、细胞克隆形成实验检测miR-557对HCC细胞增殖潜能的影响;划痕实验、Transwell实验检测miR-557对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响。　　3、RT-qPCR及蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)实验检测miR-557对HCC细胞上皮间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响。　　4、运用流式细胞仪检测miR-557对HCC细胞周期分布的影响。　　5、裸鼠皮下成瘤实验检测miR-557对HCC细胞体内成瘤潜能的影响。　　结果：　　1、运用miR-557mimics或Lv-miR-557可以显著升高MHCC-97H细胞中miR-557的表达水平，运用inhibitors或Lv-sponge-miR-557可以显著降低Huh7细胞中miR-557的表达水平，细胞可用于下一步实验。　　2、CCK-8实验、细胞克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验表明，上调miR-557表达后可抑制MHCC-97H细胞的增殖、迁移和侵袭能力，下调miR-557表达后可促进Huh7细胞的增殖、迁移和侵袭能力。　　3、与NC组相比，上调miR-557的表达水平后可增加MHCC-97H细胞中E-cadherin的表达而减少N-cadherin和Vimentin的表达;下调Huh7细胞miR-557的表达水平后则出现相反的结果。　　4、细胞周期实验表明，上调miR-557表达后可使MHCC-97H细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期;下调miR-557可促使Huh7细胞的细胞周期从G0/G1向G2/M过渡。　　5、体内实验表明，上调miR-5

关键词： 骨巨细胞瘤   Siglec-15蛋白   组织表达   生物学特性  

摘要： 目的：研究Siglec-15在骨巨细胞瘤（Giant Cell Tumor of Bone,GCTB）组织中的表达，并探讨Siglec-15在GCTB组织中表达与患者临床特征之间的关系。检测Siglec-15在GCTB单核基质细胞（Hs737.T）表达，通过siRNA靶向沉默Siglec-15基因，观察敲低Siglec-15表达对GCTB单核基质细胞的增殖、迁移、侵袭能力的影响。　　方法：收集河北医科大学第三医院病理科2012年1月1日至2017年12月31日GCTB肿瘤组织切片标本56例。通过免疫组织化学染色检测Siglec-15在GCTB组织中的表达，并分析Siglec-15表达与患者性别、年龄、位置、肿瘤大小、Companacci’s分期和肿瘤复发等临床特征的关系。通过免疫荧光染色和RT-PCR测定Siglec-15在Hs737.T细胞中的表达位置和表达水平。通过Siglec-15siRNA沉默Hs737.T细胞的Siglec-15基因表达。通过RT-PCR和Western Blot分别测定Siglec-15在基因和蛋白质水平的沉默效率。通过增殖、克隆形成、划痕和Transwell等实验测定Siglec-15基因表达降低对Hs737.T细胞的增殖、迁移、侵袭能力的影响。　　结果：免疫组织化学染色显示，Siglec-15阳性染色主要存在GCTB组织细胞的细胞质、细胞膜中。在56例切片样本中，其中51例表达Siglec-15阳性（91.07%）。另外，Siglec-15表达与Companacci’s分期、肿瘤复发之间差异有显著性（Plt;0.05），而与性别、年龄、肿瘤定位和肿瘤大小之间差异无显著性（Pgt;0.05）。免疫荧光染色结果显示Siglec-15在Hs737.T细胞质表达;RT-PCR显示Siglec-15mRNA在Hs737.T细胞的表达量（Siglec-15/β-actin）为1.636±0.012,属于高表达。RT-PCR证明了siRNA组的Hs737.T细胞表达的Siglec-15基因明显低于阴性对照组。另外，Western Blot证明了siRNA组的Hs737.T细胞的Siglec-15蛋白的表达明显低于阴性对照组。体外实验显示，siRNA组Hs737.T细胞的增殖、迁移、侵袭功能均明显低于阴性对照组（Plt;0.05）。　　结论：Siglec-15在GCTB组织中高表达，其表达水平在肿瘤　　Companacci’s分期、肿瘤复发中差异有显著性。Siglec-15在Hs737.T细胞中高表达。Siglec-15基因表达降低可使Hs737.T细胞的增殖、迁移、侵袭功能明显下降。这些结果提示，Siglec-15表达可能在GCTB生长、侵袭、转移中扮演重要角色，可能成为GCTB患者临床诊断、治疗和预后判断的新指标。

关键词： 骨膜细胞   蛇床子素   颌骨   兔  

摘要： 骨膜由于含有丰富的营养血管丛具有显著的再生能力。近年来,骨膜中的骨膜细胞（periosteal cells,PCs）在组织工程技术的相关研究中越来越受到关注。颌骨PCs由于在口腔手术中易于获得,使其有望应用于牙周组织工程技术实现牙周组织再生。蛇床子素（osthol,OST）已被证明可以在体内、体外促进骨组织的形成,但其对PCs的作用还有待阐明。目的通过体外分离培养兔颌骨PCs,检测细胞的增殖能力,并通过分析细胞的成骨分化能力、成软骨分化能力以及成脂分化能力,验证兔颌骨PCs的多向分化能力。比较不同浓度OST(0 mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)作用下兔颌骨PCs的形态、增殖能力、细胞迁移能力;以及细胞的成骨分化和细胞外基质表达情况,初步探讨OST对兔颌骨PCs的生物学作用。方法1.体外分离培养兔颌骨PCs,采用CCK-8（cell counting kit-8）检测细胞的增殖情况,通过结晶紫染色验证细胞集落形成能力。2.成骨诱导后,通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色、茜素红染色验证该细胞的成骨分化能力;经成软骨诱导后通过阿尔新蓝染色验证细胞的成软骨分化能力;经成脂诱导后通过油红O染色验证细胞的成脂分化能力。3.通过CCK-8检测不同浓度OST对兔颌骨PCs增殖能力的影响,通过划痕实验验证OST对细胞迁移能力的影响。4.通过Real-time PCR检测OST对颌骨PCs成骨分化相关基因表达的影响。5.通过ALP染色、ALP活性检测试剂盒来检测OST对颌骨PCs ALP表达的影响。6.通过茜素红染色及定量分析检测OST对颌骨PCs矿化结节形成的影响。7.通过Real-time PCR检测OST对颌骨PCs细胞外基质相关基因表达的影响。结果1.成功分离培养兔颌骨PCs,该细胞在体外表现出较好的增殖能力。2.兔颌骨PCs在成骨诱导7 d及21 d分别行ALP及茜素红染色、成软骨诱导21 d进行组织切片行阿尔新蓝染色、成脂诱导15 d进行油红O染色的结果均为阳性,提示所培养的PCs具有成骨、成软骨和成脂三向分化能力。***对兔颌骨PCs的形态无显著影响,对细胞的增殖在早期有一定的促进作用,但对细胞的迁移表现出轻微的抑制作用。***可影响颌骨PCs成骨分化相关基因表达,其中10-7mol/L及10-6mol/L的OST可最有效促进细胞成骨分化基因Runt转录相关因子2（runt-related transcription factor 2,Runx2）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、ALP及骨钙素（osteocalcin,OCN）的表达。***检测结果显示OST可促进颌骨PCs ALP的表达,其中10-6mol/L OST的作用最为明显。6.茜素红染色及定量分析显示OST可影响颌骨PCs的体外矿化能力,其中10-6mol/L OST的作用最为明显。7.对I型胶原（collagen type I,Col-I）、整合素β1（integrin beta 1,ITGβ1）、纤连蛋白（fibronectin,FN）、层黏连蛋白（laminin,LA）等细胞外基质相关基因表达检测结果显示,OST可影响颌骨PCs细胞外基质的合成,其中10-7mol/L的OST作用最为明显。结论兔颌骨PCs具有间充质干细胞所具有的成骨、成软骨、成脂分化能力;本实验条件下OST对兔颌骨PCs的增殖及生长无显著影响,但可影响兔颌骨PCs的成骨分化能力及细胞外基质的合成,有望与PCs联合利用牙周组织工程技术实现牙周组织再生。

关键词： Siglec-15   骨巨细胞瘤   单核基质细胞   siRNA  

摘要： 目的:研究Siglec-15在骨巨细胞瘤(Giant Cell Tumor of Bone,GCTB)组织中的表达,并探讨Siglec-15在GCTB组织中表达与患者临床特征之间的关系。检测Siglec-15在GCTB单核基质细胞(Hs 737.T)表达,通过si RNA靶向沉默Siglec-15基因,观察敲低Siglec-15表达对GCTB单核基质细胞的增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法:收集河北医科大学第三医院病理科2012年1月1日至2017年12月31日GCTB肿瘤组织切片标本56例。通过免疫组织化学染色检测Siglec-15在GCTB组织中的表达,并分析Siglec-15表达与患者性别、年龄、位置、肿瘤大小、Companacci’s分期和肿瘤复发等临床特征的关系。通过免疫荧光染色和RT-PCR测定Siglec-15在Hs 737.T细胞中的表达位置和表达水平。通过Siglec-15 si RNA沉默Hs 737.T细胞的Siglec-15基因表达。通过RT-PCR和Western Blot分别测定Siglec-15在基因和蛋白质水平的沉默效率。通过增殖、克隆形成、划痕和Transwell等实验测定Siglec-15基因表达降低对Hs 737.T细胞的增殖、迁移、侵袭能力的影响。结果:免疫组织化学染色显示,Siglec-15阳性染色主要存在GCTB组织细胞的细胞质、细胞膜中。在56例切片样本中,其中51例表达Siglec-15阳性(91.07%)。另外,Siglec-15表达与Companacci’s分期、肿瘤复发之间差异有显著性(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤定位和肿瘤大小之间差异无显著性(P>0.05)。免疫荧光染色结果显示Siglec-15在Hs 737.T细胞质表达;RT-PCR显示Siglec-15 m RNA在Hs 737.T细胞的表达量(Siglec-15/β-actin)为1.636±0.012,属于高表达。RT-PCR证明了si RNA组的Hs 737.T细胞表达的Siglec-15基因明显低于阴性对照组。另外,Western Blot证明了si RNA组的Hs 737.T细胞的Siglec-15蛋白的表达明显低于阴性对照组。体外实验显示,si RNA组Hs 737.T细胞的增殖、迁移、侵袭功能均明显低于阴性对照组(P<0.05)。结论:Siglec-15在GCTB组织中高表达,其表达水平在肿瘤Companacci’s分期、肿瘤复发中差异有显著性。Siglec-15在Hs 737.T细胞中高表达。Siglec-15基因表达降低可使Hs 737.T细胞的增殖、迁移、侵袭功能明显下降。这些结果提示,Siglec-15表达可能在GCTB生长、侵袭、转移中扮演重要角色,可能成为GCTB患者临床诊断、治疗和预后判断的新指标。

关键词： CRLF2基因   急性B淋巴细胞白血病   细胞增殖   化疗耐药  

摘要： 目的:研究比较不同类型CRLF2基因表达异常引起的CRLF2表达上调对急性B淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphocytic leukemia,B-ALL)细胞系Nalm6增殖、细胞周期及对化疗药物敏感性的影响,探讨其可能的作用机制。方法:分别构建空载体和4种不同CRLF2基因表达异常的荧光质粒,即CRLF2过表达、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、CRLF2突变型(F232C)和Vector,用慢病毒载体系统包装带有GFP荧光标记的CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C的慢病毒和对照病毒,同时建立CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C慢病毒稳定感染Nalm6细胞系和对照病毒稳定感染Nalm6细胞系;实时定量PCR方法(q PCR)及Western Blot方法验证转染后CRLF2基因及蛋白表达水平在Nalm6细胞系中上调;CCK-8和流式细胞术检测CRLF2不同类型基因异常引起的基因表达上调对细胞增殖、周期影响;Western Blot检测CRLF2不同类型基因表达异常对增殖、周期蛋白表达的影响。高通量药敏检测CRLF2不同基因异常对19种化疗药物的药物敏感性的影响。转录组测序技术(RNA-seq)比较CRLF2不同基因异常引起的基因表达变化。结果:成功建立CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C慢病毒感染B-ALL细胞系及对照病毒感染的B-ALL细胞系,4种CRLF2基因表达异常均可引起CRLF2表达上调,同时促进Nalm6细胞增殖。RNA-seq检测到在CRLF2突变型(F232C)中JAK/STAT通路表达上调,Western blot检测到F232C中p-STAT5蛋白表达明显增强。RNA-seq检测到系统性红斑狼疮(SLE)和转录失调通路在CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C过表达Nalm6细胞系中都表达上调,造血细胞系、破骨细胞分化等通路在大多数过表达Nalm6细胞系中表达下调。在5种细胞系中,表达F232C的细胞系对地塞米松的半抑制浓度(IC50或GI50)与对照组及表达CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2的细胞系相比明显增高,对地塞米松耐药。结论:CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C基因过表达均可促进B-ALL细胞增殖,并激活JAK/STAT等信号通路。同时导致对多种化疗药物敏感性减低,特别是CRLF2突变型(F232C)对地塞米松明显耐药,对研究地塞米松在B-ALL中耐药提供一个新的研究思路。

关键词： 氧化石墨烯   聚乳酸   牙髓干细胞   成骨分化  

摘要： 目的:构建氧化石墨烯（Graphene oxide,GO）与聚乳酸（Poly-L-Lactic Acid,PLLA）结合的氧化石墨烯/聚乳酸（GO/PLLA）复合支架,检测其生物相容性,并进一步探讨其对人牙髓干细胞（Human Dental Pulp Stem Cells,hDPSCs）增殖能力、粘附、迁移及成骨向分化的影响。方法:（1）将不同质量的GO分别与等量PLLA结合,得到GO质量分数分别为0.15%、0.20%、0.25%的GO/PLLA,应用扫描电子显微镜检测复合支架的表面形态。运用傅里叶转换红外光谱分析检测支架的成分。（2）GO/PLLA充分消毒后,浸入含10%FBS的完全培养基中,在37℃、5%CO2的细胞培养环境中放置48 h,得到的浸提液用于培养hDPSCs,分别在1、3、5天用CCK-8法检测波长450 nm处的OD值,以检测支架的生物相容性。另外,将细胞直接接种在支架上,3天后通过活死荧光染色观察GO/PLLA对hDPSCs形态的影响。（3）将hDPSCs接种在GO/PLLA上,12 h后对细胞骨架进行染色,在荧光倒置显微镜下观察细胞的粘附伸展形态,以验证细胞在GO/PLLA表面的粘附效果。（4）CCK-8法检测不同质量分数的GO/PLLA对hDPSCs增殖能力的影响。（5）划痕实验检测支架对细胞迁移的影响:用不含FBS的载体浸提液培养hDPSCs,每隔6 h在显微镜下拍照,对划痕面积进行统计分析。（6）GO/PLLA浸泡在成骨诱导液中,得到的GO/PLLA成骨诱导液用于细胞的矿化诱导。诱导14天后进行茜素红S染色;分别在7、14天时进行碱性磷酸酶染色及ALP活性。（7）用GO/PLLA分别培养细胞7、14天后,检测hDPSCs成骨分化相关基因（RUNX2,ALP,COL1及OCN）的表达量,分析细胞的成骨向分化能力。结果:（1）GO与PLLA分别分散在溶剂中,两者结合得到不同浓度的GO/PLLA复合支架,肉眼观呈白色絮状固体。扫描电子显微镜显示,GO呈皱褶片状,PLLA呈小球串样粘附在GO表面。傅里叶转换红外光谱分析表明有新的化学键生成,表明两者相结合。（2）GO/PLLA浸提液培养细胞后,hDPSCs增殖能力与对照组无明显统计学差异。活死荧光染色发现,经GO/PLLA培养后,hDPSCs呈长梭形,有细长的突起,轮廓清晰,胞质均匀,胞核位于细胞中央,与阴性对照组形态类似,没有显著差别。（3）对接种在GO/PLLA上的细胞进行细胞骨架染色,荧光倒置显微镜显示,hDPSCs能在GO/PLLA表面粘附生长,且细胞呈长梭形或多角形,有细胞突起,胞质均匀,胞核圆且位于细胞中央。（4）当GO/PLLA复合支架中GO质量分数为0.15%时,细胞增殖能力增强,且高于0.20%、0.25%GO/PLLA,有统计学差异;而GO质量分数为0.20%、0.25%时,细胞增殖速度有下降趋势。（5）划痕实验结果表明,0.15%GO/PLLA细胞迁移率比对照组高,其余两组均低于对照组。（6）用GO/PLLA培养hDPSCs 14天后,茜素红S染色显示有钙化结节形成,第7、14天的碱性磷酸酶染色均呈阳性,ALP活性增强。（7）成骨向分化相关基因（RUNX2,ALP及COL1）表达不同程度增加,而OCN的表达没有明显差异。结论:（1）GO与PLLA成功结合,且GO/PLLA对hDPSCs生物相容性良好。细胞能粘附在支架表面,并维持其正常的生长形态。（2）GO浓度为0.15%时,GO/PLLA对hDPSCs的增殖能力与迁移速度起促进作用。（3）GO/PLLA能够促进hDPSCs的成骨分化。