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关键词： 肺腺癌   CENPK   TCGA   Oncomine   PrognoScan   组织芯片   A549   EMT   GSEA   CENPK   慢病毒   裸鼠成瘤实验  

摘要： 第1章引言肺癌不仅是全球最常见的肿瘤之一,也是全世界癌症患者的主要死亡原因,其发病率和死亡率在所有癌症中位居首位。肺腺癌是其中最普遍的亚型,在肺癌中占比最大。对于肺癌的治疗,除了外科手术、放化疗之外,靶向治疗和免疫治疗为肺癌的治疗提供了新的方向。但由于其耐药性、有效率及不良反应等问题,治疗效果仍然不够理想。目前,肺癌患者远期生存率仍然很低,其5年生存率只有4%17%。因此,研究肺癌,尤其是研究肺腺癌中异常表达的基因对进一步阐明其发生和发展的相关机制,确定预后标志物及治疗相关靶点至关重要。着丝粒蛋白K（centromere protein K,CENPK）,也称为P33,属于着丝粒蛋白家族中的一员,在维持动粒正常功能中起重要的调节作用,是细胞有丝分裂进程中的必要条件之一。目前有关于CENPK在肿瘤中产生的影响及具体机制的研究报导甚少。少量研究表明,CENPK是一种促癌基因,可以促进肝癌和卵巢癌中癌细胞的增殖和转移。然而,关于CENPK在肺腺癌中的生物学功能及预后价值,鲜有文献报道,因此仍需进一步深入研究探讨。第2章CENPK在肺腺癌中的表达及其临床相关性的分析目的:了解CENPK在肺腺癌中的表达水平,探究CENPK的差异表达与肺腺癌患者的各项临床病理参数之间的关系及其临床预后意义。方法:利用公共数据库,使用生物信息学分析方法,结合免疫组织化学染色、Western blotting和q RT-PCR,探究并验证CENPK在肺腺癌中的表达水平。其次,根据公共数据库中CENPK的表达数据和肺腺癌患者的临床数据,分别采用Kaplan-Meier、单因素及多因素Cox生存分析进一步探究CENPK的差异表达与肺腺癌患者的各项临床病理参数之间的关系及其临床预后意义。结果:生物信息学分析及q RT-PCR实验结果显示CENPK m RNA表达水平在肺腺癌中升高,Western blotting及免疫组织化学染色实验结果表明CENPK蛋白表达水平在肺腺癌细胞系及组织中均升高。并且CENPK的高表达水平与肺腺癌患者淋巴结转移和病理分期呈正相关,有统计学差异（P<0.05）。此外,CENPK的高表达水平与肺腺癌患者预后不良显著相关（P<0.05）,且多因素Cox分析表明,CENPK可以作为肺腺癌患者预后不良的独立预测因子。结论:CENPK在肺腺癌中高表达,其表达水平与肺腺癌患者淋巴结转移和病理分期成正相关,CENPK的高表达水平与肺腺癌患者预后不良有关,且可作为肺腺癌患者预后的独立预测因子。第3章CENPK对肺腺癌细胞生物学行为的影响及其机制的体外研究目的:在第2章研究结果的基础上,进一步探究CENPK对肺腺癌细胞生物学功能的影响及可能参与的潜在调节通路。方法:首先利用si RNA干扰肺腺癌细胞系A549中CENPK的表达,并将si RNA-NC转染至A549细胞系作为阴性对照组。通过CCK-8及细胞克隆形成实验检测A549细胞增殖能力变化,通过细胞划痕实验和transwell迁移实验检测A549细胞迁移能力的变化,通过transwell侵袭实验检测A549细胞侵袭能力的变化,通过Western blotting探究干扰CENPK的表达后对A549细胞中上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transitions,EMT）的影响。最后通过生物信息学分析方法,利用癌症基因组图谱（The cancer genome atlas,TCGA）数据库中CENPK在肺腺癌中的表达数据,进行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）,探究CENPK的高表达在肺腺癌中肯可能参与的潜在调节通路。结果:干扰CENPK在肺腺癌细胞系A549中的表达后,与对照组相比,A549细胞的增殖及迁移能力明显降低。Western blotting检测发现:干扰CENPK表达后,上皮标记物（E-cadherin）的蛋白表达水平显着增加,间质标志物（N-cadherin,Vimentin）和转录因子（Snail）的水平明显降低,证明CENPK表达降低可抑制EMT过程。最后,通过GSEA分析结果显示CENPK在肺腺癌中的高表达主要与DNA修复、E2F TARGETS、细胞周期（G2M CHECKPOINT）、MTORC1信号通路及PI3K/AKT/MTOR信号通路密切相关。结论:干扰CENPK的表达后肺癌细胞系A549的增殖、迁移能力下降,且A549细胞中EMT过程被抑制,CENPK可能参与的潜在调节通路是DNA修复、E2F TARGETS、细胞周期（G2M CHECKPOINT）、MTORC1信号通路及PI3K/AKT/MTOR信号通路。第4章CENPK对肺腺癌细胞系裸鼠体内成瘤的影响目的:通过体内实验进一步验证干扰CEN

关键词： 翼状胬肉   成纤维细胞   TGF-β1   上皮间充质转化   Oxymatrine  

摘要： 目的:探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制剂氧化苦参碱(OM)对翼状胬肉成纤维细胞(HPFs)增殖、迁移和侵袭的影响,并初步探索其作用机制,为预防、治疗及防止术后翼状胬肉复发提供新的方向。方法:1.通过原代细胞培养获得正常结膜成纤维细胞(NFs)和HPFs,观察细胞形态,并应用ICC法鉴定细胞。2.采用CCK-8法、细胞划痕实验、Transwell细胞侵袭实验分别检测NFs、HPFs细胞增殖、迁移和侵袭能力。3.通过RT-qPCR、WB分别检测NFs、HPFs中TGF-β1及EMT相关指标E-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白的表达变化。4.利用CCK-8法检测不同浓度及相同浓度OM不同作用时间对HPFs增殖的影响。5.用适宜浓度OM处理HPFs,分为未处理组(HPFs组)和处理组(OM组),检测两组间细胞迁移和侵袭能力、TGF-β1与EMT相关指标mRNA及蛋白的变化情况。结果:1.成功培养、纯化、鉴定NFs、HPFs。两者中波形蛋白(Vimentin)呈阳性,细胞角蛋白(CK)呈阴性,结合其细胞形态,可鉴定为成纤维细胞。***-8法、细胞划痕和Transwell侵袭实验结果示:HPFs的增殖、迁移及侵袭能力均强于NFs,差异有统计学意义(P<0.05)。***-qPCR 及 WB 结果示:HPFs 中 TGF-β1 与 Vimentin mRNA 及蛋白表达量均高于NFs,而E-cadherin低于NFs,差异均具有统计学意义(P<0.05)。***能抑制HPFs的增殖,最适抑制浓度和时间为4mg/ml、48h。***组TGF-β1与Vimentin mRNA及蛋白表达量均较HPFs组降低,而E-cadherin较HPFs组升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。此外,OM组细胞迁移与侵袭能力均较HPFs组减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:***和HPFs在形态结构、生长增殖、迁移侵袭等方面存在明显差异,推测翼状胬肉中成纤维细胞发生的生物学特征转变,可能与TGF-β1 及 EMT 相关。***可抑制HPFs增殖、迁移和侵袭能力,并呈时间、浓度依赖性。其作用与部分下调TGF-β1,逆转EMT相关指标密切相关,可能成为预防、治疗及防止术后翼状胬肉复发的新辅助治疗药物,但其具体的作用机制还有待深入研究。

关键词： 年龄因素   干细胞衰老   人嗅黏膜间充质干细胞   细胞增殖能力   定向诱导分化  

摘要： 目的 明确不同年龄段人嗅黏膜间充质干细胞(Olfactory Mucosa Mesenchymal Stem Cells,OM-MSCs)生物学特性的差别,观察不同年龄段hOM-MSCs在细胞增殖、细胞凋亡、细胞老化、分化潜能等的改变,为探索年龄因素对hOM-MSCs生物学特性的影响提供信息,为自体OM-MSCs应用于临床治疗提供有效参考。 方法 收集鼻黏膜组织样本,按照志愿者的年龄将样本分为:儿童组(4-10岁)、青年组(20-50岁)和老年组(63-87岁),培养出原代hOM-MSCs后,体外扩增用于实验。具体实验方法如下:使用流式分析各年龄组间充质干细胞表面标记物的表达率,从而鉴定干细胞纯度。使用台盼蓝染色法检测各年龄组hOM-MSCs存活率。使用CCK8试剂盒检测各年龄组P4代hOM-MSCs传代后第1、2、4天的增殖情况,比较各年龄组hOM-MSCs增殖率。使用流式细胞仪检测各年龄组hOM-MSCs细胞周期各个分期的比例。通过RT-PCR检测各年龄组hOM-MSCs增殖相关基因c-Fos、c-Jun及细胞周期调控相关基因P53、P21的表达情况。通过流式细胞仪检测各年龄组hOM-MSCs细胞凋亡情况。利用RT-PCR检测凋亡相关基因Caspase8、NF-κB、Bcl-2表达水平。通过SA-β-Gal染色,统计各年龄组中hOM-MSCs染色阳性细胞数占总细胞数的比值,得到老化细胞的比例。用RT-PCR对各年龄组hOM-MSCs细胞中SIRT1表达水平进行检测。对各年龄组hOM-MSCs进行诱导成脂分化,比较各组成脂分化潜能,诱导21天后,进行成脂分化基因PPAR-γ表达量的检测,分析各年龄组成脂分化潜能的差别。对各年龄组hOM-MSCs进行诱导成软骨分化,诱导21天后,检测软骨细胞标志物COL-2的表达量,分析各年龄组成软骨分化潜能的差别。对各年龄组hOM-MSCs使用标记的JC-1测量线粒体功能的膜电位水平。通过使用活性氧检测试剂盒以及SOD检测试剂盒测量各年龄组hOM-MSCs细胞内ROS含量以及SOD活力。 结果 各年龄组间充质干细胞表面标记物CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD146表达率均在95%以上,提示单纯年龄因素不影响hOM-MSCs干细胞纯度。各年龄组在传代后培养第1天及第4天时细胞存活率无统计学差异,提示单纯年龄因素不影响hOM-MSCs细胞存活率。各年龄组hOM-MSCs培养第1、2、4天时细胞增殖能力无明显差异,提示单纯年龄因素不影响hOM-MSCs细胞增殖能力。青年组和儿童组hOM-MSCs处于S期的细胞比例明显高于老年组(p<0.05)。各年龄组hOM-MSCs的增殖相关基因c-Jun、c-Fos表达量中儿童组表达最多,老年组表达最少,(p<0.05),提示老年组hOM-MSCs可能存在细胞周期阻滞现象。各年龄组hOM-MSCs的细胞周期调控相关基因P53、P21表达量中老年组表达最多,儿童组表达最少(p<0.05)。老年组hOM-MSCs细胞凋亡水平较青年组和儿童组明显增加(p<0.05)。各年龄组的Caspase-8表达量无统计学差异;儿童组NF-κB的表达高于青年组和老年组(p<0.05);老年组Bcl-2的表达量高于青年组和儿童组(p<0.05)。老年组hOM-MSCs SA-β-Gal染色阳性细胞较青年组和儿童组增多(p<0.05),提示:老年组hOM-MSCs 比青年组和儿童组更易发生细胞老化。儿童组hOM-MSCs SIRT1的mRNA表达水平较青年组和老年组表达增加(p<0.05),老年组和青年组组蛋白去乙化酶SIRT1表达无明显差异,说明儿童组hOM-MSCs的抗衰老能力较青年组和老年组更强。儿童组、青年组和老年组hOM-MSCs成脂诱导分化21天后成脂分化基因PPAR-γ表达量有明显差异,其中儿童组最多,老年组最少(p<0.05)。说明老年组hOM-MSCs成脂分化潜能较青年组和儿童组降低。儿童组、青年组和老年组hOM-MSCs诱导成软骨分化21天后软骨细胞标志物COL-2的表达量有明显差异,其中儿童组最多,老年组最少(p<0.05)。提示老年组hOM-MSCs成软骨分化潜能较青年组和儿童组降低。老年组hOM-MSCs线粒体膜电位凋亡率较青年组和儿童组明显增加(p<0.05)。老年组hOM-MSCs细胞内ROS较青年组与儿童组明显增加,而儿童组hOM-MSCs细胞内SOD活力较青年组与老年组明显增加(p<0.05)。 结论 (1)随着年龄的增加,hOM-MSCs处于S期的细胞比例降低、成脂成软骨分化潜能降低、细胞内SOD活力减弱、细胞凋亡相关基因NF-κB表达减少以及增殖相关基因c-Fos、c-Jun表达减少。 (2)随着年龄的增加

关键词： 肌腱干细胞   外泌体   TGF β   细胞迁移   细胞增殖  

摘要： 研究背景:肌腱损伤是指肌肉或肌腱组织活动过度引起肌腱部位的损伤,治疗后留下的疤痕导致肌腱组织结构变得脆弱容易二次断裂。目前的治疗方法无法完全修复受损的肌腱。存在于肌腱组织部位的肌腱干细胞(tendon stem cells,TSCs)具有免疫原性低、增殖速度快及腱系分化能力强等优势在肌腱组织再生领域具有很强的应用潜力。外泌体作为细胞外微环境的重要组成部分参与体内的各种生理和病理活动,其分子机制尚不清楚。因此,进一步探究外泌体对TSCs的作用及其机制成为目前肌腱损伤修复研究的重要科学问题。研究目的:研究TSCs来源外泌体对TSCs生物学功能的影响,阐明其分子机制,为今后肌腱损伤的治疗提供新的理论依据。研究方法:(1)TSCs的分离及鉴定:从大鼠髌腱组织中分离TSCs;利用流式细胞仪检测干细胞相关细胞表面分子。(2)外泌体的分离及鉴定:通过超速离心法从TSCs细胞培养上清中获取外泌体;利用透射电镜检测TSCs来源外泌体的形态特征;利用马尔文粒度仪检测TSCs来源外泌体的粒径;通过蛋白质印迹法检测外泌体相关特异性蛋白;利用激光共聚焦显微镜检测TSCs对外泌体的摄取情况。(3)TSCs来源外泌体内含物的分析:通过免疫印迹法检测外泌体的蛋白。(4)TSCs来源外泌体对TSCs的细胞增殖及迁移的影响:通过细胞增殖实验与划痕实验检测TSCs来源外泌体对TSCs的细胞增殖及迁移。(5)TSCs来源外泌体对TSCs的细胞增殖及迁移影响的分子机制:通过蛋白印迹法检测与细胞增殖及迁移相关蛋白的表达。研究结果:(1)TSCs表达CD44及CD90,不表达CD11b及CD106。(2)TSCs来源外泌体呈表面凹陷的球状,粒径为44-190 nm,且含有外泌体标志性蛋白Alix与CD63。(3)TSCs来源外泌体含有转化生长因子β(TGFβ)。(4)TSCs来源外泌体促进TSCs的细胞增殖和迁移。(5)TSCs来源外泌体显著提高TSCs的P-ERK1/2、P-Smad2/3和MMP2蛋白的表达,而TGFβ受体抑制剂(ITD 1)显著抑制TSCs来源外泌体诱导的细胞增殖和迁移及上述相关蛋白的表达。结论:TSCs来源外泌体通过TGFβ受体激活MAPK信号通路中的ERK1/2和TGF-β/Smad信号通路中的Smad2/3促进TSCs的细胞增殖和迁移,本研究结果有望为损伤肌腱的修复提供新的理论依据。

关键词： 海藻酸钠水凝胶   硬度   黏弹性   骨髓间充质干细胞   生物学响应  

摘要： 水凝胶作为一种含水量高的高分子网络材料,被广泛应用于各种组织修复中,如伤口敷料、软骨修复、骨缺损填充材料等。其中,以天然高分子材料(如明胶、壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠)制成的水凝胶具有更为突出的生物相容性。此外,通过对天然高分子链进行修饰,例如接枝细胞黏附位点或交联位点,可在体外构建类似于天然胞外基质的三维(Three dimension,3D)细胞培养平台。目前,细胞培养方式大部分都是基于二维(Two dimension,2D)平面的,虽然能够简易且大量地扩增所需细胞,但却会造成一些细胞表现出异常(较之体内)的生物学行为。传统的细胞体外培养大多基于聚苯乙烯和玻璃材质的培养板/瓶之上,这些材料所表现出来的弹性模量是非生理范围内的,因此将会造成细胞表现出异常的行为,例如较为扁平的形态、异常的极化、对于小分子药物反常的应答(敏感或不敏感)以及表型的变化等等。这些异常细胞应答的原因不仅仅来自于基底非生理范围内的硬度影响,还来自于细胞整合素分布的影响;在正常生理条件下,细胞能够从胞外基质环境中接收化学/物理信号,接收范围是360°的,而不同于2D平面上仅限于细胞背腹面的信号传递。因此,以水凝胶(含水量高的聚合物网络结构)为基础的体外细胞培养体系是一种最优的选择之一。天然高分子水凝胶不但能够作为细胞体外培养平台,也能够成为揭示胞外基质物理特性对细胞行为调控作用机制的有力工具。近年来,越来越多的研究揭示了胞外基质的物理因素对细胞重要的调控作用,诸如胞外基质的硬度、拓扑结构、黏弹性、孔隙率和降解率等,不可否认的是,同可溶性化学因子的作用一样,胞外基质的物理特性也举足轻重。天然高分子水凝胶不但具备了高的生物相容性,也拥有多种天然胞外基质特有的物理特性;且基于水凝胶的3D培养体系将会为基础细胞研究引入更多的物理变量。这些物理特性往往相互联系、相互依赖,如何单一调控某一物理特性的变化是目前研究的难点。海藻酸钠水凝胶作为天然高分子水凝胶之一,具有极优的生物相容性和人工可修饰性,其分子链由β-D-甘露糖醛酸(β-D-Mannuronic,M)和α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronic,G)按α(1-4)糖苷键键合而成,在有二价阳离子存在的条件下,分子链中的G单元同二价阳离子形成螯合交联网络结构。这种物理的交联方式被成为―蛋盒‖样交联。利用其与钙离子螯合交联的特性,可在一定范围内单一调控水凝胶的硬度、黏弹性特征而不影响其内部孔隙结构。因此,海藻酸钠水凝胶可用以探明单一物理特性如何影响细胞生物学功能,这不但有利于我们更好利用天然高分子水凝胶,还为细胞如何响应单一胞外基质的物理特性变化提供更贴近体内环境的参考数据。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)由于其优越的多向分化潜能、可获得性高、免疫排斥性小以及不涉及伦理道德等问题,已成为组织工程修复过程中重要的种子细胞之一。MSCs所处的微环境十分复杂,涉及多种化学因子和物理因素的协同作用,正常生理条件下,骨髓微环境会不断的进行重组用以维稳干细胞,使其保持在最低耗能状态。不同于体内已经成熟分化的体细胞,干细胞的有丝分裂次数有限,因此在整个细胞生命周期中,其大部分时间都处于沉默状态。当体内损伤发生,干细胞被动员后,会通过短/长距离的迁移到达损伤部位,从而参与组织修复。这个过程十分复杂,涉及化学因子和物理因子的多因素共同作用。在过去的几十年中,化学因子对于干细胞的生物学功能的影响(迁移、增殖、旁分泌和分化)被大量关注并研究,而近年来,胞外基质的物理特性开始被注意并深入研究。但目前对于胞外基质物理特性和干细胞生物学响应的相关研究大多基于2D培养条件下,虽然这些研究也能够为我们了解干细胞提供重要的参考,但如前所述,由于2D培养同体内环境的巨大差异,基于此的研究结果依旧存在局限性。相比之下,体外的3D培养更类似于体内环境。事实上,已有大量研究报道过不同的培养维度对细胞生物学应答产生的影响,有时不同的培养维度甚至可以带来相反的实验结果。鉴于此,我们的研究致力于利用海藻酸钠水凝胶为基础的3D细胞培养系统,探讨干细胞对于胞外基质物理特性,包括硬度、黏弹性的响应方式,并试图阐明其中的分子机制,为水凝胶的设计、优化提供理论基础;同时,也为体外研究干细胞生物学行为提供更贴近生理条件的模型。主要研究内容及结果如下:(1)3D培养环境下,干细胞通过迁移策略的转变和细胞核硬度的降低来应对胞外基质硬度的上调通过调节海藻酸钠的分子量和钙离子交联浓度,结合Transwell小室构建体外3D细胞趋化性迁移模型,在此模型下探究不同的胞外基质硬度对干细胞迁移行为的影响。我们的研究发现,较硬的胞外基质能够促进干细胞在三维条件下的迁移。这种迁移能力的提高伴随着整合素和基质金属蛋白酶表达的降低,然而促干细胞迁移相关

关键词： 流产   HTR-8/SVneo细胞   Sigma-1受体   增殖   迁移   侵袭  

摘要： 背景及目的妊娠是一个多环节参与的过程,任何一个环节都是影响妊娠成功的重要因素。胎盘是存在于母体和胎儿之间的屏障,在胎儿的生长发育过程中起着至关重要的作用。目前越来越多的研究开始关注于胎盘和异常妊娠之间的关系。滋养层细胞是妊娠早期胎盘组织的重要组成部分,对胎盘和胎儿的发育起到了非常重要的作用。在妊娠的成功建立和维持过程中,滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭起到了至关重要的作用。滋养层细胞的功能受损和流产的发生存在一定联系,但是其潜在的发生机制目前还不是很清楚,研究滋养层细胞的分子调控机制可以为流产的防治提供新的方向。Sigma-1受体是一种配体操纵的膜蛋白,主要位于线粒体相关的内质网膜上。Sigma-1受体最初被认为是一种阿片类受体,但是现在被认为是一种不同寻常的分子伴侣。研究发现Sigma-1受体参与了许多疾病的发生发展过程,其不仅与神经退行性疾病有关,还广泛参与了心脏疾病,卵巢储备低下和癌症等多种疾病的发生发展。Sigma-1受体在人绒毛外滋养层细胞中存在高表达,提示其可能在绒毛外滋养层细胞的生物学行为中发挥作用。目前尚未有关Sigma-1受体在滋养层细胞中的研究。我们推测Sigma-1受体可能通过影响滋养层细胞的生物学行为引起流产的发生。本研究将探讨应用Sigma-1受体拮抗剂BD1063及Sigma-1受体特异性siRNA对滋养层细胞系HTR-8/SVneo细胞增殖、迁移、侵袭生物学行为的影响,为流产的防治提供新的思路。材料与方法免疫组化验证Sigma-1受体在正常早孕人工流产患者和早期自然流产患者绒毛组织中的表达差异。Sigma-1受体拮抗剂BD1063和Sigma-1受体特异性siRNA转染处理HTR-8/SVneo细胞,q RT-PCR和Western blotting实验检测Sigma-1受体的表达水平。MTT实验检测Sigma-1受体拮抗剂BD1063和Sigma-1受体特异性siRNA转染对HTR-8/SVneo细胞增殖能力的影响。划痕实验检测Sigma-1受体拮抗剂BD1063和Sigma-1受体特异性siRNA转染对HTR-8/SVneo细胞迁移能力的影响。Transwell实验检测Sigma-1受体拮抗剂BD1063和Sigma-1受体特异性siRNA转染对HTR-8/SVneo细胞侵袭能力的影响。结果1.绒毛组织免疫组化结果显示:Sigma-1受体在正常早孕人工流产患者绒毛组织中的表达明显高于早期自然流产患者（P<0.01）;***-1受体特异性siRNA转染和Sigma-1受体拮抗剂作用后对Sigma-1受体表达水平的影响:Sigma-1受体特异性siRNA转染HTR-8/SVneo细胞后,Sigma-1受体的m RNA表达显著降低（P<0.0001）,同时Sigma-1受体的蛋白表达水平也明显降低（P<0.01）,Sigma-1受体拮抗剂BD1063作用后,Sigma-1受体的蛋白表达水平明显降低（P<0.01）;***-1受体对滋养层细胞增殖能力的影响:Sigma-1受体拮抗剂BD1063作用24h后随着BD1063浓度的增加HTR-8/SVneo细胞的增殖受到抑制,BD1063的IC50值为7μmol/L,Sigma-1受体特异性siRNA转染HTR-8/SVneo细胞48h后,与阴性对照组相比HTR-8/SVneo细胞的增殖同样受到明显的抑制（P<0.05）;***-1受体对滋养层细胞迁移能力的影响:7μmol/L Sigma-1受体拮抗剂BD1063作用24h后,与对照组相比HTR-8/SVneo细胞的迁移能力受到明显抑制（P<0.01）,Sigma-1受体特异性siRNA转染HTR-8/SVneo细胞48h后,与阴性对照组比较HTR-8/SVneo细胞的迁移能力同样受到明显的抑制（P<0.01）;***-1受体对滋养层细胞侵袭能力的影响:7μmol/L Sigma-1受体拮抗剂BD1063作用24h后,与对照组相比HTR-8/SVneo细胞的侵袭能力受到明显抑制（P<0.01）,Sigma-1受体特异性siRNA转染HTR-8/SVneo细胞48h后,与阴性对照组比较HTR-8/SVneo细胞的侵袭能力同样受到明显的抑制（P<0.01）。结论***-1受体在正常早孕人工流产患者绒毛组织中的表达明显高于早期自然流产患者;***-1受体拮抗剂BD1063和Sigma-1受体特异性siRNA转染处理HTR-8/SVneo细胞可以降低Sigma-1受体的的表达;***-1受体拮抗剂BD1063和Sigma-1受体特异性siRNA转染处理HTR-8/SVneo细胞后可以降低滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭能力,提示Sigma-1受体可能参与滋养层细胞生

关键词： 高丽槐素   CNE1细胞   细胞增殖   高通量测序   PI3K/AKT/P21通路  

摘要： 目的: 观察在体外高丽槐素对鼻咽癌CNE1细胞的增殖、迁移侵袭、凋亡和周期的影响及其潜在的作用机制,初步了解高丽槐素在动物体内的抗鼻咽癌活性,为高丽槐素应用于鼻咽癌的治疗提供实验依据。 方法: 本研究采用不同浓度的高丽槐素干预鼻咽癌CNE1细胞。首先,通过CCK-8法检测CNE1细胞在24 h、48 h、72 h的增殖情况,计算其细胞抑制率以确定细胞活力;通过细胞平板克隆形成测定法观察CNE1细胞集落形成能力;通过细胞划痕实验观察CNE1细胞的迁移能力;通过Transwell小室实验观察CNE1细胞侵袭能力;利用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况;利用高通量测序技术,分析高丽槐素干预CNE1细胞后的转录组变化,筛选潜在的PI3K、AKT、STC2、FGF2、MAPK8、P53等6个基因靶点;采用实时荧光定量PCR（RT-q PCR）验证基因PI3K、AKT、STC2、FGF2、MAPK8、P53 m RNA表达情况;利用Western Blot对PI3K、AKT、P21蛋白的表达水平进行检测,研究高丽槐素对CNE1细胞PI3K/AKT/P21通路的影响;建立裸鼠皮下鼻咽癌CNE1移植瘤模型,考察不同剂量的高丽槐素在动物体内抗鼻咽癌的疗效情况。 结果: 实验结果显示,通过CCK-8法测定,MA以时间-浓度依赖的方式显著降低CNE1细胞的活力,MA干预CNE1细胞24 h、48 h、72 h的半数抑制浓度分别为133.31μmol/L、35.52μmol/L、13.84μmol/L;细胞平板克隆形成实验显示,MA能明显抑制CNE1细胞的克隆形成;划痕实验及Transwell小室实验显示,MA能够抑制CNE1细胞的迁移和侵袭能力;细胞流式细胞术检测发现,CNE1细胞凋亡率随着MA给药浓度的升高而增加,表明MA能诱导CNE1细胞凋亡;在周期实验中发现,CNE1细胞被MA阻滞在G0/G1期;采用高通量测序,筛选出PI3K、AKT、STC2、FGF2、MAPK8、P53等6个潜在的基因靶点;利用RT-q PCR验证发现,MA能下调PI3K、AKT、STC2、FGF2、MAPK8、P53的表达,与测序结果一致;Western Blot结果显示,MA作用于CNE1细胞后,PI3K、AKT蛋白表达水平显著降低,P21蛋白表达水平显著增加;裸鼠体内移植瘤结果显示,MA能显著抑制鼻咽癌CNE1细胞裸鼠移植瘤生长,且具有浓度依赖性,随着给药浓度的增加,MA的抑瘤作用也增强。 结论: 1、高丽槐素可以抑制鼻咽癌细胞株CNE1细胞的增殖与克隆形成能力,降低鼻咽癌细胞株CNE1细胞的迁移与侵袭能力,阻滞鼻咽癌CNE1细胞G0/G1期,促进CNE1细胞的凋亡,其作用机制可能是失活PI3K/AKT/P21通路。 2、高丽槐素能有效抑制裸鼠体内鼻咽癌细胞株CNE1的生长。

关键词： 钛合金   微弧氧化   碱处理   锂   施万细胞   骨感知  

摘要： 背景:随着口腔种植临床技术的发展成熟,种植修复因其美观舒适、不破坏天然牙、咀嚼效果好等特点,逐步替代传统活动或固定修复技术成为目前口腔修复治疗的首选方案。但牙种植体也存在骨整合周期长、生物活性较差等缺点。因此,众多学者聚焦于种植体材料表面改性促进成骨、抗炎、抗菌方面的研究,却鲜有人关注对植入体周围神经反馈调节与重塑的影响。种植义齿与天然牙最大的区别在于牙周膜的存在与否,牙周膜的缺失,中断了神经反馈通路,丧失了对天然牙咬合应力分布的传导保护机制。理论上,种植义齿是无法感知机械刺激的,然而,临床实践发现患者对种植义齿有较好的触觉及定位能力,但其中具体的分子调节机制尚不明确。那么能否通过种植体材料表面改性促进植入体周围神经调节与反馈重塑过程,探究潜在的分子机制,以提高种植义齿的神经感知功能“敏锐度”成为本研究的设想。目的:通过制备载锂二氧化钛纳米复合涂层,考察其是否会影响施万细胞(SC)的生物学性能,探究改性材料促进种植体材料周围神经反馈重建的分子机制。以期更好仿生天然牙的神经感知功能,降低种植义齿的机械并发症发生风险,便于更好的临床应用。方法:通过微弧氧化(MAO)与LiOH碱液处理制备载锂二氧化钛纳米复合涂层。将钛合金(Ti-6Al-4V)命名为TC4组,MAO处理后的钛合金命名为MAO组,超纯水同温度处理的MAO组为MAO-Li0组,将MAO+LiOH碱处理后的Ti-6Al-4V命名为MAOA组(具体分为:MAO+0.025 mol/L LiOH碱处理的为MAO-Li0.025组,MAO+0.05 mol/L LiOH碱处理为MAO-Li0.05组,MAO+0.075mol/L为LiOH碱处理MAO-Li0.075组)。使用扫描电子显微镜(SEM)、X射线能谱分析(EDS)、X射线衍射(XRD)、X射线光电子谱(XPS)、接触角测量仪(CA)等观察样品形貌、元素组成与价态、晶相组成及亲水性等理化性能。通过细胞增殖活性检测(CCK-8)、吖啶橙荧光染色(AO)、实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)等方法评价复合涂层对施万细胞生物相容性的影响。结果:1.在Ti-6Al-4V基底上成功制备了载锂二氧化钛纳米复合涂层,该涂层表面呈现火山口样多孔结构,并有纳米细纹、细针样结构存在。该复合涂层主要以二氧化钛锐钛矿、金红石晶相为主,存在钛酸盐非晶相物质。该复合涂层与基底结合紧密,厚度大致为3.0±0.5μm。MAO组、MAOA组亲水性均良好,MAOA组更显著,水接触角平均仅为9.8°±0.7。该复合涂层主要包含Ti、Ca、P、Li等元素,二次改性并未导致元素化学价态变化,但元素含量有变化,Li从无到有,Al、P溶解为主,其他元素含量变化不大。复合涂层可能以二氧化钛晶体及钛酸钙、钛酸锂等非晶相物质存在。2.该复合涂层显著促进了施万细胞的增殖、黏附,同时导致神经营养蛋白-神经营养因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的m RNA表达显著增高,髓鞘形成蛋白-髓磷脂P0蛋白(MPZ)、周围髓鞘蛋白22(PMP22)的m RNA显著增高,其中实验组MAO-Li0.05效果最明显。结论:本研究制备了具有优良理化性能的载锂二氧化钛纳米复合涂层,该涂层对大鼠施万细胞表现出良好的生物活性,这种复合改性方法对种植体周围神经反馈重塑过程提供了一种优选策略。

关键词： 乳腺癌   RhebL1   增殖   转移   PI3K/Akt  

摘要： 背景和目的乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤。在女性中,乳腺癌占所有癌症发病率的25%,占所有癌症死亡人数的15%。尽管外科手术和化学疗法已经取得了显著进展,但晚期乳腺癌患者的长期生存率仍然很低,这主要归因于乳腺癌的复发或远处转移。尽管在乳腺癌的病因学和发病学研究中,已发现大量致癌基因和抑癌基因参与了乳腺癌的发生发展,但是仍需深入探索揭示乳腺癌发生和发展的分子机制,希冀获取人乳腺癌干预防治的潜在分子靶点,这具有重要的理论及实用意义。目前研究表明,乳腺癌的发病机制很复杂,由多种细胞信号分子介导并存在交叉对话(cross-talk),例如丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷酸肌醇3-激酶(Phosphoinositide3-kinase,PI3K)以及蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)等信号分子皆关联乳腺癌的发生发展。在人类诸多肿瘤研究中,PI3K/Akt信号途径通常表达异常。该通路中某些信号分子的突变亦可导致通路功能和细胞生物学行为的改变。它不仅可以调节肿瘤细胞的存活和增殖,而且与肿瘤的侵袭、转移、耐药性等密切相关。在肿瘤发生的分子机制研究中,Ras家族在肿瘤细胞生物学行为中的作用成为研究热点,且Ras家族对靶基因的调控机制和作用途径更是阐明肿瘤发展机制的研究重点。Ras家族是Ras超家族的一个重要分支。Ras超家族蛋白介导多种细胞生物学效应,例如细胞增殖、凋亡等。Ras超家族蛋白与乳腺癌之间的相关性研究表明,Ras超家族蛋白与患者的病理数据和预后密切相关。RhebL1系Ras超家族成员之一,其与乳腺癌细胞生物学行为改变的关系是本课题研究的重要切入点。本研究旨在分析人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞系中RhebL1的表达水平,探讨RhebL1对人乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭与转移等生物学行为的影响,深入揭示RhebL1影响乳腺癌细胞生物学行为及乳腺癌发生发展的分子机制,期望为乳腺癌的有效干预防治提供新的靶点。方法1 RhebL1在人乳腺癌细胞中的表达1.1采用实时荧光定量PCR法在m RNA水平检测乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中RhebL1的表达情况。1.2采用Western Blot法在蛋白水平检测乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中RhebL1的表达情况。2 RhebL1对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响及机制研究2.1建立RhebL1稳转敲减乳腺癌细胞系,利用CCK8法检测乳腺癌细胞增殖情况;利用裸鼠皮下成瘤法检测RhebL1在体内对乳腺癌细胞增殖的影响;利用流式细胞术检测细胞凋亡水平变化;利用划痕实验检测细胞迁移能力变化;利用Transwell法检测细胞侵袭能力变化。2.2 Western Blot实验技术检测在肿瘤生物学功能中发挥重要作用的相关蛋白p21及p27。2.3有变化趋势的蛋白与PI3K/Akt信号通路密切相关,我们用Western Blot检测PI3K/Akt通路相关蛋白Bax、Bcl2、PI3K、p-Akt及Akt。2.4应用PI3K/Akt信号通路的蛋白激酶抑制剂LY294002进行干预处理,应用CCK8、Transwell实验方法来检测LY294002对乳腺癌细胞增殖和迁移的作用,应用Western Blot检测相关蛋白变化。2.5使用Akt抗体和RhebL1抗体进行Co-IP实验,揭示RhebL1与Akt的相互作用。结果1 RhebL1在人乳腺癌细胞中的表达RhebL1在正常乳腺细胞和乳腺癌细胞中均有表达,且在乳腺癌细胞中的表达明显高于正常乳腺细胞(P<0.05)。2 RhebL1对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响及机制研究2.1下调RhebL1的表达抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力在乳腺癌细胞中下调RhebL1的表达能明显抑制细胞活力;敲低RhebL1的乳腺癌细胞凋亡率明显升高;敲低RhebL1后的乳腺癌细胞迁移和侵袭能力显著降低(P<0.05)。2.2下调RhebL1的表达抑制PI3K/Akt通路的活性下调乳腺癌细胞中RhebL1时能明显调控PI3K/Akt通路相关蛋白活性,Bcl2、PI3K和p-Akt蛋白表达水平明显降低,Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05);Akt蛋白表达情况无明显差异(P>0.05)。2.3 RhebL1通过Akt调控PI3K/Akt信号通路PI3K/Akt信号通路的蛋白酶抑制剂LY294002抑制了乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。应用PI3K/Akt信号通路的蛋白酶抑制剂LY294002后,乳腺癌细胞中Bcl2、PI3K和p-Akt蛋白表达水平明显降低,Bax、p21和p27蛋白表达水平

关键词： 全国生物学联赛试题   细胞生物学   试题分析  

摘要： 全国中学生生物学奥林匹克竞赛是高中生积极参与的五大学科竞赛之一,而生物学联赛是该赛制流程的一项必经环节。同时,生物学联赛是高中课堂教学的延伸,也是早期发现和培养生物学科潜在人才的重要途径。生物学联赛笔试考查的知识内容广泛,包括“细胞生物学”“生物化学”和“遗传学”等14门学科,其中“细胞生物学”是主要考查学科之一,分值占比在9.00-11.00%间;目前,尚未见对该试题系统分析的研究报道。因此,本文以近20年全国-联赛“细胞生物学”试题为研究对象,采用文献分析法、内容分析法和对比研究法,从试题结构、表现形式、考查范围和认知水平四个方面进行分析,总结出试题考查重点和变化趋势;并以福建赛区参赛选手成绩为数据,采用统计分析法对试题知识得分情况、认知水平得分情况、难度和区分度以及较难试题进行详细分析,以期了解学生的薄弱之处,为学生的备考和竞赛辅导教学提供启示。主要结论如下:1.在试题结构方面,生物学联赛细胞生物学试题的题量、分值占比基本稳定,题型命制趋于规范。试题表现形式-包括无情境、简单情境性和复杂情境性试题三类,从变化趋势上看,无情境试题相对占比呈减少的趋势,2020年仅占12.50%,复杂情境性试题有明显增加的趋势,到2020年升至75.00%,表明联赛试题更注重于让学生挖掘题干情境背景的隐藏信息,将相关知识综合运用于解决复杂性问题,因此试题难度趋大,对选手的要求也更高了。2.与现行《课程标准》相比,细胞生物学考查范围（《竞赛大纲》）拓展了“过氧化氢体和过氧化物酶体的结构功能”“细胞骨架系统的功能”“细胞周期变化”等知识;《竞赛大纲》之外考查的知识主要集中在“病毒”“细胞生物学的最新研究方法”“细胞信号转导和蛋白质分选”等,且这两部分知识从福建考生平均得分率上看普遍较低,但考查的知识在《竞赛大纲》和《课程标准》二者要求范围内福建考生得分率普遍较高,均在65.00%以上。可见,福建考生有必要依据联赛细胞生物学试题考查的内容归属（详见第二章）进行有针对性的学习。3.对试题实际考查知识的频数进行统计分析,发现细胞亚显微结构和功能主题考查重点有“细胞膜”（40次）、“细胞核和核功能”（25次）、“细胞内膜系统”（24次）等;细胞分裂主题考查重点有“细胞的分化、衰老和癌变”（27次）和“减数分裂的染色体的变化的主要特点”（19次）等。4.从认知水平角度看,试题考查了“记忆”“理解”“应用”和“分析”4个认知水平。从分值相对占比看,“记忆”和“理解”认知水平是考查重点,“分析”认知水平的考查在近5年有大幅度上升,从7.14%上升至41.67%;成绩分析表明,“记忆”和“分析”认知水平得分率较低。因此,今后考生不仅要注重基础知识的积累和训练,还需要将其知识迁移运用,从而提高记忆和分析认知水平。5.从难度上看,容易题占了34.23%,中等难度以上的试题占了65.77%,绝大多数的试题具有一定难度,这正体现了联赛的目的,即普及生物学知识同时,寻找学科特长、创新潜质的学生;从区分度上看,平均区分度值为0.39,区分度较好,在一定程度上可甄别考生学业实际水平差异,达到测试的目的。对较难试题（q≥0.70）进行具体分析,发现细胞骨架系统、细胞膜的结构和功能知识既是考查重点,也是难点,且反映出福建考生对《细胞生物学》教材及其相关知识的成果文献阅读较少,以及对实验原理的理解不够透彻。因此,教师在指导过程中,可借助《细胞生物学》教材和查找相关生物学文献对重、难点知识进一步拓展,并注重实验教学的开展。