教学课程资源库 更多>>

关键词： 结直肠癌   STAP2基因   基因表达   细胞生物学  

摘要： 目的：　　结直肠癌（CRC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在我国均居恶性肿瘤第四位。近年来，随着科学技术的发展以及相关研究的深入，CRC的诊疗技术取得很大的进展，但晚期CRC的治疗效果仍有限，预后仍不理想，因而寻找有效的早期诊断CRC的肿瘤标记物显得尤为重要。本研究拟通过了解STAP2基因在CRC组织中的表达情况，分析STAP2mRNA的表达与CRC患者临床病理指标之间的关系，探讨STAP2基因对CRC细胞生物学功能的影响，以期在CRC的早期诊断或预后判断等方面提供可能的理论依据及实验室基础。　　方法：　　1.收集正常人的大肠粘膜组织35例、大肠腺瘤组织16例，CRC组织32例、CRC癌旁组织32例作为研究对象。运用qRT-PCR检测以上各组组织中STAP2mRNA的表达水平;收集CRC患者的临床病理资料，分析STAP2mRNA的表达水平与CRC患者各临床病理指标之间的关系。　　2.将STAP2siRNA以及相对应的Negative Control(NC)分别转染至HCT-116和SW-480CRC细胞株，使用流式细胞术、CCK8试剂盒分别检测STAP2基因对CRC细胞凋亡、增殖的影响;将STAP2siRNA以及相对应的NC转染至HCT-116细胞中，使用Transwell的方法检测STAP2基因对HCT-116细胞株迁移的影响。　　结果：　　***2mRNA在各不同大肠组织中的表达情况　　分别与正常组织及癌旁组织相比，STAP2mRNA在CRC中表达显著下调，差异均具有统计学意义（P＜0.05）;与正常组织相比，STAP2mRNA在大肠腺瘤组织中的表达显著下调，差异有统计学意义（P＜0.05）;CRC癌旁组与大肠腺瘤组相比较，在癌旁组织中，STAP2mRNA的表达水平较腺瘤组表达升高，差异有显著统计学意义（P＜0.001）;正常组与癌旁组相比较、腺瘤组和CRC组相比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。　　***2基因对CRC细胞生物学行为的影响　　STAP2siRNA转染组与对照组相比，HCT116、SW480细胞的增殖率增加，差异均具有显著统计学意义（P＜0.01）;HCT116、SW480细胞凋亡显著减少，差异均具有统计学意义（P＜0.05）;HCT116细胞迁移增加，差异具有显著统计学意义（P＜0.001）。　　***2与CRC患者临床指标的关系　　STAP2mRNA的表达在CRC患者性别、年龄、肿瘤大小、分期、肿瘤的分化程度、是否有淋巴结转移、远处转移等方面差异均无统计学意义（P＞0.05）。　　结论：　　***2mRNA在CRC组织中表达下调，其表达与CRC患者性别、年龄、肿瘤大小、分期、肿瘤的分化程度、是否有淋巴结转移和是否有远处转移等均无关。　　***2基因能抑制CRC细胞的增殖和迁移，促进CRC细胞的调亡。

关键词： 视网膜色素上皮细胞   上皮-间充质转化   细胞外基质   弹性模量  

摘要： 背景:上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为间充质细胞,进而获得迁移和增殖能力的过程。有研究表明年龄相关性黄斑变性和增殖性玻璃体视网膜病变等视网膜纤维化疾病的发病机制涉及视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的EMT,具体表现为细胞连接丧失,细胞骨架重排及成分改变,增殖和迁移能力增强等,但关于RPE细胞EMT的启动机制,目前尚未完全阐明。近年来,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)刚度对细胞生物学功能的调控作用受到广泛的关注,在生理和病理情况下,视网膜ECM刚度是发生改变的,有报道证明Bruch膜的刚度随着年龄的增长可以增加至少一个数量级,而且基质刚度改变已被证实可以影响RPE细胞吞噬和炎症诱导因子的表达,但基质刚度是否调控RPE细胞的EMT过程尚待研究证实。因此,本研究拟通过构建不同刚度聚丙烯酰胺水凝胶以模拟体内视网膜ECM刚度的变化,利用形态学、功能表型和分子生物学的研究方法探究基质刚度是否可以促进RPE细胞的EMT过程,并探讨其背后的分子调控机制。方法:本研究构建不同刚度(5kPa、10kPa、20kPa和40kPa)的聚丙烯酰胺水凝胶,通过纳米压痕仪检测其弹性模量(刚度的定量指标),通过原子力显微镜检测其表面粗糙度,利用I型鼠尾胶原增加其表面细胞粘附活性,通过CCK-8检测不同刚度水凝胶浸提液的细胞毒性以验证其安全性。将ARPE-19细胞培养在不同刚度水凝胶和塑料培养板上,通过Calcein AM染色技术检测不同基质刚度对ARPE-19细胞增殖的影响;通过免疫荧光染色技术检测不同基质刚度对ARPE-19细胞中F-肌动蛋白细胞骨架组装和排布的影响;通过CultureInsert检测不同基质刚度对ARPE-19细胞迁移的影响;通过Western-blot检测不同基质刚度对ARPE-19细胞中上皮标志性蛋白(E-钙粘蛋白和闭锁连接蛋白-1)和间充质标志性蛋白(波形蛋白)的影响。结果:本研究成功制备了不同刚度的ECM体外模型,各组水凝胶的实际弹性模量分别为5.45±0.62k Pa、10.89±1.39k Pa、20.91±1.34k Pa和41.07±1.40k Pa,这与理论值基本相符;覆盖I型鼠尾胶原的水凝胶表面最大锥形凸起高度为2.60nm,这对尺寸为μm级别的ARPE-19细胞影响忽略不计;各组水凝胶浸提液对ARPE-19细胞增殖活性影响无差异,这表明了水凝胶的安全性。本研究发现随着基质刚度增加,ARPE-19细胞的形态从圆球形转变为长梭形,平均细胞面积和平均细胞纵横比增加,这表明基质刚度的增加促进ARPE-19细胞从上皮细胞形态转变为间充质细胞形态。随着基质刚度增加,F-肌动蛋白细胞骨架的组装增强、应力纤维的形成增多,F-肌动蛋白细胞骨架在低刚度组(5k Pa)表现为弥漫分布,无法形成纤维束或仅在细胞边缘形成短小的纤维束;在高刚度组(40k Pa)表现为粗长的纤维网络,所形成的应力纤维横跨整个细胞,这表明基质刚度的增加可以促进F-肌动蛋白细胞骨架的组装和应力纤维的形成。ARPE-19细胞在单位面积的细胞总面积随着基质刚度的增加而增加,这表明基质刚度增加促进ARPE-19细胞的增殖。ARPE-19细胞的相对迁移面积随着基质刚度增加而增加,这表明基质刚度的增加促进ARPE-19细胞的迁移。此外,本研究发现随着基质刚度增加,ARPE-19细胞中上皮标志性蛋白E-钙粘蛋白和闭锁连接蛋白-1表达水平降低,间充质标志性蛋白波形蛋白的表达水平升高。结论:基质刚度增加影响ARPE-19细胞的形态,促进F-肌动蛋白细胞骨架组装和应力纤维形成,促进ARPE-19细胞的增殖和迁移,抑制上皮标志性蛋白E-钙粘蛋白和闭锁连接蛋白-1的表达,促进间充质标志性蛋白波形蛋白的表达水平。以上研究结果从形态学、功能表型和蛋白表达三方面证明了基质刚度的增加可以促进ARPE-19细胞发生EMT。

关键词： 狼疮肾炎   足细胞   IL-17RB   LPS   NF-κB信号通路  

摘要： 目的:系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种多系统的自身免疫性炎症疾病,狼疮肾炎(Lupus nephritis,LN)是最常见的并发症,足细胞损伤参与了LN患者疾病的发生发展。白介素17B受体(Interleukin 17B Receptor,IL-17RB)异常表达与多种炎症性疾病有关。IL-17RB在上皮细胞和各种内分泌组织和器官的粘膜组织表达,其中肾组织中表达最高,那么IL-17RB在LN肾组织足细胞中的表达及其作用有待进一步探究。通过检测LN患者和LN模型鼠足细胞上IL-17RB的表达,进一步体外实验探讨在LPS诱导炎症环境中IL-17RB对足细胞功能及其与NF-κB信号通路是否相关,为发掘LN潜在的治疗靶点提供基础实验依据。方法:(1)采用ELISA法测LN患者、非LN的SLE患者和健康对照者血清中IL-17RB的表达;通过观察MRL/lpr小鼠的一般体征,用肌氨酸氧化酶法测小鼠血清肌酐,以及HE、马松和六胺银染色观察小鼠肾组织病理情况鉴定是否符合LN样改变。(2)免疫组化法测LN患者、健康对照者、MRL/lpr小鼠(LN模型鼠)和C57BL/6小鼠肾组织肾小球中IL-17RB的表达水平。(3)培养成熟的小鼠MPC-5足细胞系,LPS是炎性刺激物,分为0、25、50、75和100ug/ml五个浓度,CCK-8法测24h、48h后对细胞活性的影响,根据结果选取75ug/ml的LPS分别刺激24h和48h,并利用q RT-PCR法检测IL-17RB的表达水平。(4)选取75ug/ml LPS刺激足细胞48h,随后进行siRNA转染,分为无LPS刺激的空白对照组、LPS刺激、LPS刺激的无效转染组(LPS+NC组)以及LPS刺激的IL-17RB特异转染组(LPS+siRNA组),用q RT-PCR法检测转染24h后足细胞的IL-17RB m RNA相对表达,流式细胞术检测转染48h后足细胞的IL-17RB蛋白表达率。(5)足细胞功能的检测:CCK-8法测空白对照组、LPS+NC组和LPS+siRNA组足细胞增殖,利用流式细胞术测足细胞凋亡,划痕和transwell法测足细胞迁移能力的改变。(6)Western Blot法检测空白对照组、LPS+NC组和LPS+siRNA组足细胞中NF-κB信号通路IKBα和P-P65蛋白的表达。结果:(1)LN患者血清中IL-17RB的表达高于对照组(P<0.05)。(2)与对照组相比,LN患者和LN模型鼠足细胞中IL-17RB的表达均增高(P<0.05)。(3)LPS刺激足细胞后,细胞活性呈浓度和时间依赖性递减(P<0.05),以浓度75ug/ml刺激48h为著。较空白对照组,75ug/ml LPS刺激48h IL-17RB的表达呈增高趋势(P=0.077)。(4)用siRNA进行转染足细胞后,与LPS组和LPS+NC组相比,LPS+siRNA组的IL-17RB表达减少(P<0.05),而与空白对照组无明显差异(P>0.05),LPS组与LPS+NC组之间也无差异(P>0.05)。(5)siRNA转染足细胞48h后,与LPS组相比,LPS+siRNA组细胞增殖能力提高,细胞凋亡率降低(P<0.05),而细胞迁移能力的差异没有统计学意义(P>0.05)。(6)siRNA转染足细胞48h后,LPS+siRNA组中IKBα蛋白相对表达量较LPS组增加,而P-P65蛋白相对表达量降低(P<0.05)。结论:(1)IL-17RB在LN患者和LN模型鼠肾脏足细胞中高表达。(2)体外LPS诱导足细胞炎症,IL-17RB的表达呈增高趋势。高表达的IL-17RB可能通过激活NF-κB信号通路,抑制足细胞增殖和促进足细胞凋亡,但对细胞迁移能力无明显作用。

关键词： ISL   结肠癌   细胞焦亡   GSDMD/GSDME蛋白   铁死亡   量效曲线   抗炎   细胞增殖  

摘要： 第一部分:高浓度的异甘草素ISL有抗肿瘤作用目的:初步探究高浓度的异甘草素ISL致结肠癌细胞死亡的方式。方法:首先,将ISL与结肠癌细胞共同孵育,使用显微镜观察细胞形态学上的变化;采用CCK-8试剂盒检测ISL对四种结肠癌细胞株SW480、SW620、HCT-116、HT-29细胞活力的影响;平板克隆形成实验用于探究ISL是否可以抑制SW480和SW620细胞的克隆形成能力;通过用DAPI染色法以及Caspase3/7试剂盒来确认高浓度的ISL对细胞凋亡信号的变化情况;细胞伤口愈合实验检测ISL对结肠癌细胞运动迁移能力的影响。另外检测铁死亡发生脂质过氧化的指标,即丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的变化;以及使用还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)试剂盒,检测细胞内GSH含量的变化;再通过流式细胞仪和荧光显微镜,检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的表达变化。最后,使用实时荧光定量PCR技术检测细胞焦亡相关因子的表达;用蛋白质免疫印迹技术,检测ISL对细胞焦亡指标Caspase-1、GSDMD、GSDME、IL-1β和铁死亡指标GPX4的表达变化情况。结果:本课题的研究结果显示,高浓度的ISL对结肠癌细胞的活力,克隆形成能力,迁移能力均具有明显的抑制作用。然而在低浓度ISL作用下有提高细胞活力的现象,这部分内容放在第二部分探究。在高浓度ISL致结肠癌死亡方式的探究中,其并未使结肠癌细胞发生明显的铁死亡现象,但是其能显著提高结肠癌细胞的ROS水平。ISL除了能提高结肠癌细胞凋亡信号以外,根据蛋白质免疫印迹技术的结果,ISL作用于结肠癌细胞后,能明显提高Caspase-1、GSDMD、GSDME、IL-1β的表达,这说明了 ISL能使结肠癌细胞发生细胞焦亡。结论:ISL能使结肠癌细胞发生除凋亡方式以外的死亡一细胞焦亡。第二部分:低浓度和极低浓度的ISL对细胞生物学活性的影响目的:探究ISL低浓度时对结肠癌细胞增殖的影响和极低浓度下对HCE细胞的抗炎作用。方法:CFSE实验检测低浓度下ISL对结肠癌细胞增殖的影响;Caspase3/7试剂盒检测低浓度ISL对细胞凋亡信号表达量的影响;CCK-8试剂盒检测ISL作用于HCE细胞,观察量效曲线;通过建造HCE细胞的高渗模型,用RT-PCR的方法来研究极低浓度下ISL对炎症因子表达的变化。结果:CCK-8实验显示,不同浓度ISL作用于HCE细胞,对细胞活力的影响类似第一部分其对结肠癌细胞活力的影响,均呈现倒“V”字型趋势。CFSE实验结果显示低浓度的ISL并没有促进结肠癌细胞的增殖,反而使细胞凋亡信号增加。极低浓度的ISL能够下调炎症因子的表达。结论:低浓度的ISL不能促进结肠癌细胞增殖;极低浓度的ISL有抗炎作用。

关键词： 细胞生物学   聚乙二醇   细胞融合  

摘要： 细胞融合是细胞工程的一项核心技术,聚乙二醇(PEG)介导的细胞融合法是最经济、简单的细胞融合技术。但在本科生实验教学过程中,实验效果并不理想。为了获得高效稳定的细胞融合率,试验通过改变细胞悬液制备方法和pH对细胞融合率的影响进行研究,结果表明利用肝素钠抗凝的血细胞保存168 h,pH为8时细胞融合率最高,可达30.88。

关键词： 绝经后骨质疏松   骨髓间充质干细胞   长骨   颌骨   增殖能力   分化能力  

摘要： 目的研究雌性健康和绝经小鼠长骨及颌骨来源骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖、分化能力。方法18只小鼠通过双侧去卵巢法建立绝经小鼠动物模型(OVX组),另外18只小鼠仅剪去卵巢周围组织作为正常对照组(SHAM组),低钙饲养12周,取两组小鼠颌骨及长骨HE染色观察的组织形态变化;取两组小鼠长骨和下颌骨来源的BMSCs细胞(BMMSCs和JMMSCs),分为OVX-BMMSCs组、SHAM-BMMSCs组、OVX-JMMSCs组以及SHAM-JMMSCs组,培养1~7 d,采用CCK-8法检测4组BMSCs细胞的增殖特性,采用油红O和阿利新蓝染色并定量检测4组BMSCs细胞的脂滴含量和软骨基质含量。结果与SHAM组相比,OVX组小鼠的骨小梁排列较紊乱,骨吸收明显,出现了较多大小规则不同的骨凹陷窝;CCK-8法检测结果显示,4组BMSCs细胞随着培养时间的延长,细胞的增殖活性呈升高趋势(P=0.034),从培养第4天开始,JMMSCs的增殖能力明显强于BMMSCs组(P<0.05);油红O定量分析结果显示,JMMSCs形成的脂滴含量均较少于BMMSCs(P<0.001);阿利新蓝染色及ALP定量结果显示,JMMSCs染色深度与BMMSCs比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论雌性健康小鼠和绝经小鼠长骨与颌骨来源的BMSCs都显示出不同的生物学特性。

关键词： 医学细胞生物学   教学改革   科研能力  

摘要： 文章通过分析当前高校医学细胞生物学教学中存在的问题,提出以医学细胞生物学为教学改革试点,优化教学内容,扩展新技术实验,加大对实验平台支持,改革各考核内容占比。通过对医学细胞生物学的教学进程进行改革,构建以实践能力和科研素质为核心,以理论知识体系、实践能力体系、科研素质体系与考核评价体系为驱动的科研能力导向型人才培养模式,为强化医学生知识学习和技能训练,促进医学生实践能力和科研创新能力的发展奠定基础。