关键词:
马钱苷元
急性髓系白血病
细胞分化
泛素化
CDK2蛋白
摘要:
目的:研究山茱萸环烯醚萜类提取物马钱苷元对人急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)MOLM-13细胞CDK2蛋白泛素化的影响,寻找到其对抑制AML细胞增殖、诱导细胞分化、阻滞细胞周期以及促进细胞凋亡的影响,从而发现AML的潜在治疗靶点。为进一步治疗提供可能性。
方法:临床研究:研究纳入了6名急性髓系白血病患者和6名健康正常人。分别记录性别、年龄、外周血髓系原始细胞比例。提取外周血单个核细胞后,进行蛋白免疫印迹,检测急性髓系白血病患者和健康正常人单个核细胞CDK2蛋白表达水平的差异。实验研究:1.细胞干预与细胞增殖检测:使用山茱萸提取物马钱苷元干预人急性髓系白血病MOLM-13细胞,通过CCK-8法检测细胞抑制率。***2表达水平研究:通过蛋白免疫印迹检测细胞CDK2蛋白的表达水平,并利用实时荧光定量PCR技术检测细胞CDK2 m RNA的水平变化。3.泛素化降解途径验证:为了明确CDK2蛋白水平减少是否通过泛素化降解途径,在马钱苷元处理的同时,加入蛋白酶体抑制剂MG132,进行蛋白免疫印迹检测,观察CDK2蛋白表达水平的变化。4.细胞分化观察:通过流式细胞术结合细胞分化表面标志物CD11b分析处理后细胞的分化水平;通过姬姆萨染色观察药物干预后细胞核形态的变化。5.细胞周期与凋亡分析:结合流式细胞术与细胞周期检测试剂盒检测细胞周期变化,利用细胞凋亡检测试剂盒分析细胞凋亡情况,并通过蛋白免疫印迹观察药物干预后细胞中有丝分裂检查点蛋白Cdc20和Mad2表达水平的变化。
结果:1.与正常人相比,急性髓系白血病患者外周血单个核细胞的CDK2蛋白表达水平较正常人显著增高。***8结果表明与对照组相比,马钱苷元干预MOLM-13细胞后,细胞抑制率明显升高。3.蛋白免疫印迹表明马钱苷元干预MOLM-13细胞后CDK2蛋白表达水平减少,q PCR结果显示马钱苷元干预MOLM-13细胞后CDK2 m RNA水平并未降低。4.流式细胞术表明马钱苷元干预MOLM-13细胞后,细胞分化表面标志物CD11b表达水平升高。姬姆萨染色观察到与对照组相比马钱苷元干预后MOLM-13细胞核质比明显减小,细胞核形态由圆形变为肾形、马蹄形、分叶形等。5.为了探究CDK2蛋白表达减少是否通过泛素化降解途径,使用蛋白酶体抑制剂MG132干预MOLM-13细胞。蛋白免疫印迹结果显示,MG132干预后CDK2蛋白减少的情况被逆转。6.流式细胞术结果显示马钱苷元干预后,MOLM-13细胞细胞周期阻滞于G2/M期,细胞凋亡率显著升高。蛋白免疫印迹显示药物干预后,MOLM-13细胞有丝分裂检查点蛋白Cdc20和Mad2表达水平显著降低。
结论:马钱苷元能够通过调控急性髓系白血病MOLM-13细胞CDK2蛋白的泛素化降解来实现其生物效应,可以有效抑制MOLM-13细胞的增殖、诱导细胞的分化、阻滞细胞周期以及促进细胞凋亡。