关键词:
吴茱萸多糖
分离
结构
体外酵解
摘要:
吴茱萸(Euodiae fructus)为芸香科植物吴茱萸(Euodia rutaecarpa(Juss.)Benth)的干燥近成熟果实,又名漆辣子、食茱萸等,主要分布在我国的江西、湖南、浙江等地,是江西传统道地药材“三子一壳”之一。现有的研究表明吴茱萸具有抗炎、抗肿瘤、保护心血管系统及中枢神经系统等功能。多糖是植物发挥生物活性的重要因素之一,然而对吴茱萸的研究主要为生物碱、挥发油及苦味素类,对吴茱萸多糖的研究鲜有报道。多糖结构是其发挥生物活性的基础,本实验以江西赣州产的吴茱萸为研究对象,通过水提醇沉法制备吴茱萸粗多糖,根据多糖保留率、脱色率及分子量等指标,确定最适合的脱色方法。使用乙醇分级沉淀的方法从吴茱萸多糖(Euodiae fructus polysaccharide,EFP)中获得均一的多糖组分,进一步采用比色法、高效凝胶渗透色谱仪、离子色谱、甲基化处理结合气相色谱-质谱和核磁共振等技术手段分析纯化后EFP的化学组成、分子量分布和糖苷键类型,推测其可能的一级结构,再通过体外酵解实验分析EFP对肠道菌群生长情况及菌群丰度变化情况的影响,为后续EFP对生物活性的研究及功能性食品的开发提供理论依据,主要的研究内容与结论概括如下:
(1)筛选吴茱萸粗多糖的最佳脱色方法,测定脱色和脱蛋白后吴茱萸多糖的理化性质、纯化后不同组分的单糖组成和分子量分布。比较阳离子树脂、阴离子树脂、大孔吸附树脂等10种常用的不同树脂、活性炭和2%过氧化氢对水提醇沉后吴茱萸多糖的脱色效果。结果表明,用活性炭在对吴茱萸粗多糖进行脱色后中性糖保留率、糖醛酸保留率和脱色率分别为94.26%、91.79%和68.74%,分子量分布未发生明显变化。说明活性炭脱色效果较好、不会明显损失糖含量和破坏多糖结构,较适宜用于吴茱萸粗多糖的脱色。经活性炭脱色、Sevag脱蛋白处理后的吴茱萸多糖(EFP)得率为4.12%,中性糖含量为38.42%,糖醛酸含量为39.26%,蛋白质含量为6.86%。分级醇沉后得到的两个均一组分(EFP-20和EFP-40),得率分别为49.79%和19.78%,中性糖含量分别为41.94%和47.92%,糖醛酸含量分别为38.95%和45.60%,蛋白质含量分别为0.14%和2.60%,分子量分别为1.78×10~7 Da和9.70×10~4 Da。单糖组成的结果表明EFP-20和EFP-40中含有单糖的种类与各单糖的比例不同。EFP-20主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成,各单糖的含量为20.83%、23.16%、31.52%和23.64%;与EFP-20相比EFP-40中的单糖种类较多,主要含有半乳糖醛酸(35.55%),半乳糖(25.49%),阿拉伯糖(22.27%)和葡萄糖(10.26%),其鼠李糖(4.37%)含量较低,并且检测到了少量的岩藻糖(1.26%)和甘露糖(1.20%)。红外光谱中EFP-20和EFP-40在1740 cm-1处均存在吸收峰,说明两种多糖中均含有甲氧基取代。上述结果表明EFP-20和EFP-40为两种结构不同的果胶多糖。
(2)对纯化后的吴茱萸多糖的一级结构进行测定。通过甲酯化试剂盒测得EFP-20和EFP-40的甲酯化度分别为27.76%和17.06%,利用核磁氢谱(1H NMR)测定EFP-20和EFP-40中乙酰化度分别为24.62%和8.12%。甲基化结果表明EFP-20中主要糖苷键类型为1,2,4-Rhap、1,2-GalpA、1,4-Galp和1,4-GalpA,含量分别为21.82%、14.33%、11.05%和11.05%。EFP-40中含有20多种不同的糖苷键,主要的糖苷键为1,4-GalpA、T-Araf和T-Galp,含量分别为22.75%、11.28%和6.66%。1D/2D NMR对EFP-20和EFP-40的异头构型和糖苷键连接顺序的分析表明EFP-20为含有RG-Ⅰ结构域的果胶多糖,该结构域的主链为α-1,4-GalpA与α-1,2,4-Rhap糖残基相连的重复单元,侧链为β-1,4-Galp通过α-Rha的O-4位连接在主链上。EFP-40结构较为复杂,根据现有的核磁信号只能推测出可能存在HG结构域,存在α-1,4-GalpA与α-1,4-GalpA(OMe)相互连接的片段。
(3)通过体外模拟酵解实验对纯化后吴茱萸多糖组分的体外酵解特征进行研究。通过体外酵解实验,发现EFP-20和EFP-40酵解过程中糖含量、p H值均降低,分子量被降解,总短链脂肪酸含量呈上升趋势,这说明EFP-20和EFP-40可以被肠道菌群分解利用并产生对人体有益的代谢产物。通过对门和属水平上菌群丰度的研究发现RG-Ⅰ型果胶多糖EFP-20可显著增加拟杆菌属等有益菌的丰度,使有益菌转化为