关键词:
吴茱萸碱
反向分子对接
网络药理学
逆转耐药
分子机制
摘要:
研究背景:据全球癌症报告显示,死亡率位列前三的癌症是肺癌、结肠癌以及乳腺癌。我国作为中药资源大国,许多中药活性小分子都显现出较好的抗肿瘤活性。其中,吴茱萸碱作为中药吴茱萸的主要成分之一,具有广泛的生物学效应,例如扩张血管、治疗胃肠道疾病、头痛和产后出血,抑制肥胖、抗肿瘤等多种药理作用,然而由于其存在水溶性差、生物利用度低等缺点阻碍了其成为有效的临床抗癌药物。因此课题组前期对其进行结构修饰,将活性较好的吴茱萸碱衍生物10-羟基吴茱萸碱与具有靶向肿瘤特性的吲哚醌结构进行拼合得到吲哚醌-吴茱萸碱拼合物(9A-9D),通过MTT实验发现其对非小细胞肺癌有显著的抗肿瘤活性。
研究目的:本文拟进一步探究化合物9B逆转PC9/GR、MCF-7/ADR和SW620/5-FU耐药的机制,为其开发成肿瘤耐药逆转剂及临床应用提供一定的科学依据。
研究方法:通过MTT法评价化合物9B对耐药细胞的逆转耐药效果,流式细胞仪测其对耐药细胞株细胞凋亡和细胞周期阻滞的影响,通过反向分子对接以及网络药理学预测化合物9B逆转耐药可能的核心靶点和作用机制,基于此结果进一步用Western blot法验证多药耐药相关蛋白、通路蛋白以及凋亡蛋白表达的调节。
研究结果:(1)从MTT实验结果可以看到,化合物9B不仅具有优于阳性药的抗增殖作用,在与阳性药联合使用时,非细胞毒性的浓度下也可以大大增加阳性药的抗肿瘤效果,通过对比9B对三种耐药细胞的逆转倍数发现9B对SW620/5-FU细胞的逆转耐药效果最强;细胞凋亡实验表明,化合物9B呈剂量依赖的方式促进三种耐药细胞的凋亡,相对于对照组来讲,SW620/5-FU细胞凋亡率显著高于其他两种细胞;细胞周期结果表明化合物9B对耐药细胞具有一定的周期阻滞效果;通过观察化合物9B对耐药细胞的迁移率发现,9B以剂量和时间依赖的方式抑制细胞的划痕愈合,其中同样以SW620/5-FU细胞的抑制效果最为显著,提示9B在逆转耐药方面对SW620/5-FU细胞具有较高的选择性,因此用其进行下一步机制研究。(2)采用反向分子对接以及网络药理学的方法预测化合物9B逆转肿瘤耐药作用的主要靶点以及主要机制。通过查阅文献以及使用Pharm Mapper预测化合物9B的潜在靶点,挑选Z-score>0.8的人源靶标蛋白共51个;基于Gene Cards数据库,以“drug resistance in tumor”为关键词进行检索,得到与肿瘤耐药相关的靶点20817个,以相关性Relevance>5.56筛选得到1999个基因,通过将9B的潜在靶点与肿瘤耐药的相关靶点进行取交集,得到了29个靶点基因,绘制韦恩图;在STRRING数据库中导入交集基因得到PPI网络图,包含29个节点,81条蛋白互作关系,利用Cytoscape软件筛选出最重要的10个核心靶点;将核心靶点录入DAVID数据库,对9B作用肿瘤耐药的靶点进行GO和KEGG分析,筛选靠前的生物过程或通路,用Omicshare进行可视化,从图中可知共涉及27条通路,其中包含21条癌症通路,8条信号通路。其中与癌症耐药相关的信号通路有6条。使用Autodockvina将化合物9B与PI3K、AKT和NF-κB分别对接,所得vina评分均为阴性且小于-6,表明9B对PI3K、AKT和NF-κB具有良好的结合活性。基于此结果进行后续的耐药机制验证。(3)Western Blot实验结果表明,在SW620/5-FU细胞中P53、BAX、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达显著增加,Bcl-2蛋白表达被抑制。同时显著增大了BAX/Bcl-2的比值。这说明9B可通过线粒体途径诱导SW620/5-FU细胞凋亡的发生。PI3K/AKT通路是重要的细胞内信号传导通路。9B可能通过抑制SW620/5-FU细胞中AKT的磷酸化活化,从而抑制其下游信号因子IKK的活化,进而抑制了IκB的磷酸化,使得NF-κB无法释放并发挥转录因子功能,表明9B对PI3K/AKT/NF-κB信号通路传导的抑制导致了SW620/5-FU细胞增殖和迁移的抑制。进而降低细胞中P-gp、MRP2和ABCG2蛋白的表达水平,减少肿瘤细胞膜蛋白的外排,提高5-氟尿嘧啶在SW620/5-FU细胞中的蓄积,从而提高药物的疗效,并通过阻断P-gp蛋白所介导的多重耐药通路,达到逆转结肠癌耐药的目的。研究结论:(1)化合物9B对非小细胞肺癌、结肠癌以及乳腺癌均具有抗增殖作用,能促进细胞凋亡,阻滞细胞周期和抑制细胞迁移,并且以SW620/5-FU细胞效果最佳,提示9B通过上述生物过程逆转耐药。(2)化合物9B可能通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路逆转肿瘤耐药(3)化合物9B通过抑制P-gp、MRP2和ABCG2耐药相关蛋白,促进细胞凋亡来逆转SW620