关键词：
糖尿病肾病
肾系膜细胞
马钱苷
梓醇
AGEs
摘要：
目的:随着世界范围内糖尿病人数的不断增长,糖尿病肾病(DN)作为糖尿病最常见的微血管并发症之一,已成为引起终末期肾病的主导因素。肾小球系膜细胞为肾脏固有细胞,在维持肾小球滤过屏障组成和功能上起到关键作用。本文以肾脏系膜细胞为研究对象,通过体外细胞实验探讨生地、山茱萸特征成分马钱苷、梓醇保护晚期糖基化终末产物(AGEs)诱导肾小球系膜细胞(GMC)损伤的作用机制,从而为DN的治疗提供新的方法与思路。方法:体外细胞实验:(一)马钱苷、梓醇对AGEs致系膜细胞损伤的保护作用:基于AGEs诱导系膜细胞损伤模型,加入马钱苷、梓醇干预。MTS法检测GMC增殖率;流式细胞仪检测GMC细胞周期变化:Western-blot检测核转录因子(NF-κ B)的表达;Elisa法检测GMC上清中LN、Col Ⅰ、CTGF含量;透射电镜观察GMC形态变化。(二)马钱苷、梓醇对AGEs致系膜细胞损伤内质网应激的影响:体外采用AGEs诱导系膜细胞损伤,观察马钱苷、梓醇对系膜细胞内质网应激保护的分子机制。Western-blot检测内质网应激通路蛋白GRP78、IRE1、XBP1、CHOP的表达;加入内质网应激抑制剂4-PBA,验证马钱苷、梓醇对系膜细胞内质网应激保护的作用机制。(三)马钱苷、梓醇对AGEs致系膜细胞线粒体自噬的影响:体外采用AGEs诱导系膜细胞损伤,观察马钱苷、梓醇对GMC线粒体自噬保护的分子机制。试剂盒检测GMC线粒体内ATP酶活性;免疫荧光检测线粒体膜电位变化;Western-blot 检测线粒体自噬通路蛋白 Keap1、Nrf2、PINK1、Parkin、p62、LC-3的表达;加入自噬抑制剂3-MA,验证马钱苷、梓醇对GMC线粒体自噬保护的药效机制。结果:细胞实验:(一)马钱苷、梓醇对AGEs致系膜细胞损伤的保护作用:①MTS结果显示,马钱苷、梓醇能显著抑制AGEs诱导的GMC增殖,且呈浓度依赖性(P<0.05,P<0.01)。②马钱苷、梓醇能上调G0/G1期,降低S期比例,阻止细胞由G0/G1期进入S期,从而抑制细胞增殖(P<0.05,P<0.01),减轻GMC损伤。③Elisa结果显示,马钱苷、梓醇能够下调GMCs上清中LN、Col Ⅰ、CTGF水平,减少ECM表达,与模型组相比差异显著(P<0.05,P<0.01),且呈浓度相关性。④Western-blot结果显示马钱苷、梓醇能显著抑制NF-κ B蛋白的活化。⑤马钱苷、梓醇能有效改善AGEs引起的系膜细胞亚细胞器损伤,减轻内质网管腔与线粒体嵴肿胀,减轻系膜细胞内质网与线粒体损伤,从而改善DN。(二)马钱苷、梓醇对AGEs致系膜细胞内质网应激的保护作用:①马钱苷、梓醇均能不同程度减少GMC内质网应激相关蛋白GRP78、IRE1、CHOP蛋白的表达,以及XBP1的分化,与模型组相比具有差异显著(P<0.05,P<0.01)。②加入内质网应激抑制剂4-PBA,马钱苷、梓醇与抑制剂相比,药效并未减弱,说明马钱苷、梓醇通过抑制GMC内质网应激,减轻AGEs诱导的GMC损伤。(三)马钱苷、梓醇对AGEs致系膜细胞线粒体自噬的保护作用:①马钱苷、梓醇能够上调GMC中线粒体ATP酶活性,上调线粒体膜电位,与模型组相比差异显著(P<0.05,P<0.01),且呈浓度相关性。②马钱苷、梓醇均能不同程度减少GMC线粒体自噬相关蛋白Keap1、Nrf2、PINK1、Parkin、LC-3蛋白的表达,抑制Nrf2蛋白的核转位以及p62的磷酸化,与模型组相比具有差异显著(P<0.05,P<0.01)。③加入自噬抑制剂3-MA,马钱苷、梓醇与抑制剂相比,药效并未减弱,说明马钱苷、梓醇通过减少GMC线粒体自噬,减轻AGEs诱导的GMC损伤。结论:实验结果表明马钱苷、梓醇能够显著改善AGEs诱导的系膜细胞损伤,其作用机制可能与改善系膜细胞内质网应激,减少线粒体自噬,抑制细胞增殖等有关。
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