关键词:
吴茱萸次碱(Rut)
辣椒素受体(TRPV1)
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)
衰老
Sirt1
摘要:
目的:高糖导致的大血管和微血管病变继而引发的一系列血管并发症是糖尿病致残和致死的首要原因。近年来高糖诱导血管内皮细胞衰老在糖尿病血管并发症中的作用受到了广泛的关注。在高糖状态下,氧化应激水平明显增加,可下调细胞长寿蛋白Sirt1,从而加速内皮细胞衰老。Sirt1作为去乙酰化酶,可通过抑制P53活性而减少细胞周期抑制蛋白P21的表达而产生抗衰老效应。吴茱萸次碱(rutaecarpine,Rut)是传统中药吴茱萸的主要活性成分,是一种五环类吲哚喹唑啉类生物碱,具有广泛的心血管保护作用,其主要心血管保护效应均为激活辣椒素受体(Transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)。前期有研究发现Rut有抑制ROS生成的抗氧化效应,还有文献报道Rut可抑制高血压状态下的内皮祖细胞衰老。因此本课题的研究目的是在培养的人脐静脉内皮细胞上观察Rut对高糖诱导内皮细胞衰老的影响,并进一步确定Rut抗衰老效应机制是否涉及TRPV1/[Ca2+]i/Sirt1途径。方法:在培养的人脐静脉内皮细胞株HUVEC中,加入30mM高糖孵育24h诱导高糖损伤模型,同时给予不同浓度的Rut(10-6mol/L,3×10-6mol/L,10-5mol/L)处理细胞,观察Rut对高糖诱导的内皮损伤的影响:CCK-8检测细胞活力,AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测自噬相关蛋白LC3II/LC3I判断对自噬的影响。并进一步观察Rut对高糖诱导的内皮衰老的影响:PI染色流式细胞仪检测细胞周期,β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞数,Western blotting检测长寿蛋白Sirt1和衰老相关蛋白P21的表达,荧光探针DCFH-DA法检测ROS生成。为确定TRPV1/[Ca2+]i信号途径是否介导Rut的抗内皮细胞衰老机制,在给予不同浓度的Rut10min前预先给予工具药TRPV1竞争性拮抗剂CAPZ(10-5mol/L),30min前预先给予钙调蛋白CaM阻断剂W-7(10-5mol/L)或胞内钙螯合剂BAPTA-AM(10-5mol/L),观察其是否能阻断Rut的效应,同时采用Fluo-3 AM钙离子荧光探针法用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度确定Rut是否激活TRPV1促进Ca2+内流。结果:CCK-8检测及流式细胞凋亡结果表明,30mM高糖孵育24h可显著抑制内皮细胞活力,促进内皮细胞凋亡,而预先给予Rut可恢复HUVEC的细胞活力,并轻度抑制细胞凋亡,其效应可被TRPV1阻断剂CAPZ所部分阻断;Western blotting检测自噬相关蛋白LC3II/LC3I发现,Rut对高糖状态下内皮细胞自噬并无明显影响。流式细胞周期检测结果显示,Rut可增加HUVEC细胞增殖期(S和G2/M)的百分比,解除高糖造成的细胞周期(G0/G1期)阻滞;β-半乳糖苷酶染色结果发现,30m M高糖可显著增加内皮中衰老细胞数量,而Rut可剂量依赖性减少衰老细胞数目;Western blotting结果表明,Rut可剂量依赖性地上调长寿蛋白Sirt1表达,抑制衰老相关蛋白P21表达水平;荧光显微镜检测ROS荧光强度发现Rut可抑制高糖诱导的ROS生成;流式检测胞内钙浓度表明,Rut可轻度升高内皮细胞内Ca2+水平,其效应可被CAPZ所阻断。预先给予TRPV1阻断剂CAPZ,CaM阻断剂W-7或胞内钙螯合剂BAPTA-AM均可部分取消Rut的抗衰老效应及对Sirt1和P21的调节作用。结论:Rut可抑制高糖诱导的内皮细胞衰老,其机制与激活TRPV1/[Ca2+]i信号途径,上调长寿蛋白Sirt1,进而下调衰老相关蛋白P21,抑制ROS生成有关。