关键词:
阿尔茨海默病
信号通路
山茱萸环烯醚萜苷
细胞自噬
摘要:
目的:1、观察山茱萸环烯醚萜苷(Cornel Iridoid Glycoside,CIG)对糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)活性和蛋白表达的影响,及其对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)神经保护作用机制的研究。2、明确CIG增强蛋白磷酸酶2A活性抑制tau蛋白过度磷酸化的作用机制。方法:(1)第一部分:CIG对WT/GFX拟AD模型大鼠的影响,(1)将Wistar大鼠随机分为六组:假手术组、假手术组+CIG(60 mg/kg)、WT/GFX模型组、CIG小剂量组(60mg/kg)、CIG大剂量组(120 mg/kg)、阳性药物组(美金刚3 mg/kg)。(2)模型制备及给药:Wistar大鼠灌胃给予CIG7天,同时进行Morris水迷宫实验检测空间学习记忆能力,第7天记录逃避潜伏期;第8天大鼠立体定位单侧侧脑室注射WT/GFX各200 u M,制备tau蛋白过度磷酸化拟AD模型;第9天进行水迷宫实验,记录逃避潜伏期后处死,取脑组织。采用免疫荧光方法观察脑内海马神经元的形态变化,应用Western blotting方法检测皮层和海马PI3K/AKT信号通路以及突触相关蛋白的表达水平。(2)第二部分:CIG对GSK-3β转染N2a细胞的影响,小鼠神经瘤母细胞(Neuro-2A cell,N2a细胞)中瞬时转染入野生型GSK-3β(Wt GSK-3β)质粒,建立tau蛋白过度磷酸化模型,实验分为空白组、空白组+CIG(200μg/m L)、Wt GSK-3β、Wt GSK-3β+CIG(50μg/m L)、Wt GSK-3β+CIG(100μg/m L)、Wt GSK-3β+CIG(200μg/m L)。应用Western blotting方法检测tau蛋白在多个位点的磷酸化水平,GSK-3β、p-GSK-3β-ser9以及细胞自噬通路中多个蛋白的表达水平。(3)第三部分:CIG对Src转染N2a细胞的影响,(1)确定Src质粒最佳转染条件:将Src质粒DNA(0.2,0.4,0.6,0.8μg)瞬时转染入小鼠神经瘤母细胞,观察不同量Src对PP2A催化亚基C磷酸化和tau蛋白磷酸化的影响。(2)将0.6μg Src质粒DNA转染入N2a细胞,24h后加入CIG(50,100,200μg/m L)共同孵育24h,观察CIG对Src,PTP1B,p-PP2Ac及tau蛋白磷酸化的作用。结果:(1)第一部分:Morris水迷宫实验显示:模型组与假手术组相比,逃避潜伏期明显增加,CIG灌胃给药使模型组大鼠逃避潜伏期明显降低;免疫荧光实验:模型组神经元树突数量减少,明显断裂,且排列杂乱,给予CIG后,树突断裂显著减少,排列逐渐恢复整齐;Western blotting实验显示:模型组与假手术组相比,tau蛋白在Thr217及PHF-1(识别Ser396/404位点)位点的磷酸化水平明显增加,CIG使这些位点的磷酸化显著降低;模型组皮层和海马中p-GSK-3β-ser9表达降低,即GSK-3β激活,CIG灌胃给药通过增加p-GSK-3β-ser9表达,抑制GSK-3β活性;模型组PI3K/AKT/GSK-3β信号通路活性被抑制,p-IGF-I R、p-PI3K、PI3K-110α、p-PDK1、p-AKT表达量均减少,即IGF-I R、PI3K、PDK1、AKT活性被抑制,同时模型组p-IRS1增加,IRS1活性被抑制,CIG灌胃给药使IGF-I R、PI3K、IRS1、PDK1、AKT活性明显增加,进而抑制GSK-3β活性;模型组中突触相关蛋白p-synapsin、Synaptophysin、PSD95表达量明显减少,CIG能升高p-synapsin、Synaptophysin、PSD95蛋白表达。(2)第二部分:N2a细胞过表达GSK-3β蛋白,p-GSK-3β-ser9、GSK-3β表达增加,tau蛋白在199/202、PHF-1位点磷酸化表达明显增加;给予CIG处理后,p-GSK-3β-ser9明显增加,即GSK-3β活性被抑制,GSK-3β总蛋白表达降低,tau蛋白在199/202、PHF-1位点磷酸化水平显著降低。N2a细胞过表达GSK-3β后,给予CIG50、100、200μg/m L三个剂量,Beclin1、LC3Ⅱ、ATG12蛋白表达水平升高,即细胞自噬水平提高。(3)第三部分:(1)转染Src(0.2,0.4,0.6μg)质粒DNA到N2a细胞,Src蛋白表达明显增加,p-PP2Ac水平上调,PP2Ac蛋白总量表达无变化,tau蛋白在Ser199/202、Ser396位点磷酸化显著增加;转染0.8μg Src质粒DNA到N2a细胞与转染0