关键词：
吴茱萸配方颗粒
生物碱
LC-MS
含量测定
肝毒性
人肝癌HepG2细胞
MTT法
摘要：
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）***（Dode）Huang或疏毛吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）***（Dode）Huang的干燥近成熟果实,为临床常用中药。吴茱萸配方颗粒是用符合炮制规范的吴茱萸饮片作为原料,经现代制药技术提取、浓缩、分离、干燥、制粒、包装精制而成,它解决了传统汤剂制备和使用不方便的问题,具有免煎易服、安全卫生、携带方便等优点。本研究采用液质联用（LC-MS）技术建立了吴茱萸配方颗粒中10种成分同时定量的分析方法,并采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法对其中4种生物碱类成分及柠檬苦素的肝细胞毒性作用进行研究,初步探讨吴茱萸致肝毒性的物质基础,为吴茱萸配方颗粒的质量控制及评价提供参考,为其安全性评价提供先期的实验依据。第一部分液质联用法同时测定吴茱萸配方颗粒中10种成分的含量目的:基于HPLC-MS技术建立一种高灵敏度的方法对吴茱萸配方颗粒中吴茱萸碱、吴茱萸次碱（Rut）、去氢吴茱萸碱、吴茱萸卡品碱、芦丁、橙皮苷、金丝桃苷、柠檬苦素、咖啡酸、绿原酸10种成分进行同时定量研究。方法:色谱柱为Diamonsil C18柱（150×4.6 mm,5μm）;柱温为40℃;流速为0.8 mL/min;进样量为10μL;流动相为A-B（0.12%乙酸/1mmol/L乙酸铵-乙腈）,梯度洗脱,梯度洗脱程序如下:0～6 min,85%A72%A;6～10 min,72%A32%A;10～11 min,32%A10%A;11～22min,10%A;总分析时间为22 min;再快速返回初始比例A-B（85:15,V/V）,运行10 min。采用多重反应监测（MRM）的扫描方式下正负离子同时监测,离子喷雾电压为5500和-4500 V,源温度（TEM）为650℃,雾化气（GS1,N2）为60 psi,辅助气（GS2,N2）为65 psi,气帘气（N2）为25 psi。结果:10种被测成分的峰面积和浓度在一定浓度范围内均有良好的线性关系（r≥0.9954）,日内和日间精密度相对标准偏差（RSD）值分别小于2.48%和2.90%,24 h内的稳定性良好,平均回收率范围为95.7%104.6%。结论:该方法简便快速、灵敏度高、专属性好,可用于吴茱萸配方颗粒中10种成分的同时定量分析,为吴茱萸配方颗粒的质量控制及评价提供科学依据。第二部分吴茱萸致肝毒性的物质基础研究目的:探讨吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱、吴茱萸卡品碱、柠檬苦素是否具有肝细胞毒性作用,探讨吴茱萸致肝毒性的物质基础。方法:人源肝癌HepG2细胞分别经不同浓度的5种吴茱萸主要单体成分吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱、吴茱萸卡品碱、柠檬苦素孵育24 h后,采用MTT法检测药物对HepG2细胞存活率的影响。结果:MTT法显示,5～200μmol/L的吴茱萸碱、5～200μmol/L的吴茱萸次碱、50～200μmol/L的去氢吴茱萸碱、25～200μmol/L的吴茱萸卡品碱和10～200μmol/L的柠檬苦素对人肝癌HepG2细胞活力有明显的抑制作用（P<0.01或P<0.05）,且呈现较好的量效关系。结论:吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱、吴茱萸卡品碱、柠檬苦素对HepG2细胞均有不同程度的毒性作用。
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