关键词:
EVO
肺癌
Notch3
DNA甲基化
摘要:
研究背景:肺癌是我国发病率和死亡率均排第一的恶性肿瘤。从病理组织学上分类,肺癌主要可分为小细胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)。根据最新分期标准所采纳的数据,其中NSCLC患者占据的比例高达92%。癌症发生发展伴随多种信号通路异常。Notch信号通路通过相邻细胞之间的相互作用调节细胞、组织、器官的分化和发育。Notch信号通路平衡细胞增殖、分化、凋亡的作用,某种程度上表明该通路可能与肿瘤细胞的异常调控相关,因而针对Notch信号通路的靶向性药物成为临床治疗和研究的热点之一,尤其是与肺癌预后呈显著负相关的Notch3受体。表观遗传学是近年来热门研究方向,其中DNA甲基化是最早被广泛描述且研究最深入的表观遗传学部分。抑癌基因的高甲基化研究较多,而对促癌基因的低甲基化研究较少,因此寻找促癌基因的表观遗传学修饰剂是非常有意义的。我国的天然药物资源丰富,有望成为其重要物质来源。吴茱萸是我国中医临床常用中药,从中提取的重要生物碱类成分吴茱萸碱(Evodiamine,EVO),据报道有较好的抗肿瘤活性,可作为潜在的抗肿瘤药物。基于目前研究现状,本文将从体外细胞模型研究EVO对Notch通路的调控作用及机制,并通过小鼠肺癌预防模型从体内验证。研究目的:本研究我们主要考察了 EVO对Notch通路的调控作用及其作用机制。在实验中,我们采用两种NSCLC细胞系A549和H1299,从体外考察EVO对Notch通路关键蛋白的影响及其作用机制。采用人胚肺成纤维细胞(MRC-5)细胞系来检测EVO对正常细胞的毒性。在体内采用肺癌预防模型,即乌拉坦诱导FVB小鼠肺癌模型来进一步探索EVO在体内对NSCLC的预防作用及机制。研究方法:1.评价EVO对肺癌细胞活力的影响选用A549、H1299、H1975三种NSCLC细胞系以及正常人胚肺成纤维细胞MRC-5,根据MTT实验的实验步骤,检测EVO作用48h后对细胞活力的作用并计算IC50值,选取合适的细胞系及给药浓度作为体外研究模型。2.检测EVO对A549和H1299细胞增殖和细胞周期的影响经MTT法筛选出A549和H1299作为后续实验研究对象旧物作用时间为48h。EdU法检测EVO对两种细胞系增殖能力的影响;收细胞样品,PI标记流式细胞术检测EVO对两种细胞系周期的影响;提取细胞总蛋白,western blot实验检测周期相关的蛋白表达水平变化。3.考察EVO对A549和H1299恶性程度的影响肿瘤恶性程度可用肿瘤细胞迁移、浸润能力以及细胞干性来评价,EMT转化促进肿瘤细胞的浸润以及肿瘤的转移。划痕实验检测EVO对两种细胞系迁移能力的影响,琼脂糖克隆实验检测EVO对两种细胞系克隆形成的影响,流式细胞术检测细胞干性标志物CD44和CD133的表达。提取细胞蛋白样品,western blot检测EMT标志蛋白 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 的蛋白表达水平。4.评价EVO对Notch信号通路关键蛋白的影响提取细胞蛋白样品和RNA,通过western blot实验和RT-PCR实验检测Notch信号通路中Notch关键蛋白表达水平和mRNA水平以及下游靶基因的mRNA水平。5.研究EVO调控Notch信号通路的机制提取细胞DNA样品,MSP实验验证EVO对两种细胞系中Notch3启动子区CpG岛的甲基化作用,甲基化质谱测序检测每个CG位点的甲基化程度,western blot检测EVO对DNA甲基转移酶(DNMTs)蛋白表达的影响,RT-PCR检测Notch3基因转录水平。6.小鼠肺癌模型的建立以及评价EVO的药效采用乌拉坦腹腔注射诱导肺癌模型,分别经EVO 0.5%CMC-Na、5 mg/kg、10 mg/kg灌胃至22周,考察EVO在肺癌形成和发展过程中的化学预防作用。统计动物体重变化、肺结节数目、脏器指数,western blot检测肺组织中Notch信号通路中关键蛋白的表达,HE染色检查肺病理改变,免疫组化检查肺组织Notch3蛋白的表达。7.统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析,多组间均数比较采用One way ANOVA,p<0.05表示具有显著学差异。采用GraphPad 5.0数据分析软件作图,数据结果以Mean±SD 表示。研究结果:***显著抑制A549和H1299的细胞活力经EVO给药48h后,15μM和5 μM EVO对A549和H1299分别表现出显著的抑制作用。根据MTT检测结果,确定EVO给药浓度:在A549给药0,4,8,16 μM;H1299给药0,1,2,4μM,均小于对应的IC50值。***抑制A549和H1