关键词:
吴茱萸次碱
肺血管重构
肺动脉平滑肌细胞
增殖
凋亡
摘要:
背景:肺动脉高压(PAH)是一种恶性高致死性疾病。肺血管重构是PAH持续发展且难以逆转的病理基础,其中肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的异常增殖是肺血管重构的主要原因之一。因此,通过抑制PASMCs的异常增殖进而逆转肺血管重构,在PAH的治疗中显得尤为重要。此外,PAH患者受损细胞中具有类似于肿瘤细胞的糖酵解作用,糖酵解与细胞的快速增殖密切相关,从能量代谢的角度来研究PAH的发病机制将有望为PAH的治疗另辟蹊径。吴茱萸次碱(Rut)具有舒张血管、抑制血管生成、抗氧化应激、调控细胞增殖凋亡等功能,在心血管疾病中具有广泛的应用。然而它与低氧性肺动脉高压(HPH)的关系目前鲜有报道。本课题以人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)为研究对象,建立HPH体外模型,研究Rut对低氧诱导的HPASMCs的作用及相关机制。方法:1、Rut 在 HPASMCs 中 IC50 的测定常氧下用CCK-8法测定Rut在HPASMCs中的IC50,并探索其最佳给药浓度。2、体外HPH低氧模型的构建构建HPASMCs体外低氧模型,用CCK-8和细胞计数法测低氧下HPASMCs的增殖率,流式细胞术测凋亡率。3、Rut在低氧诱导的HPASMCs中的功能研究将Rut按0、0.5、5、50μmol·L-1剂量在低氧下对HPASMCs进行分组干预后,按上述方法测细胞的增殖率、凋亡率、上清乳酸含量。用qRT-PCR测HIF-lα的 mRNA 表达,用 Western-B1ot 测 HIF-1α 及下游靶基因 p53、p21、GLUT-1、PCNA、VEGF、EPO的蛋白表达。4、Rut在低氧诱导的HPASMCs中的作用机制研究用siRNA对HIF-1α进行干预后,用5μmol·L-1的Rut对细胞进行给药处理。按上述方法测低氧下HPASMCs的增殖率、凋亡率、上清乳酸含量;HIF-lα及下游靶基因p53、p21、GLUT-1、PCNA的蛋白表达。5、GLUT-1在低氧诱导的HPASMCs中的作用研究用siRNA对GLUT-1进行干预后,用CCK-8和细胞计数法测低氧下HPASMCs的增殖率,用Western-Blot测PCNA的蛋白表达。结果:常氧下,Rut 在 HPASMCs 中的 IC50 为 43.5μmol·L-1。低氧下,HPASMCs的增殖率显著升高,凋亡减少,细胞上清的乳酸含量增加。5μmol·L-1以上剂量的Rut干预细胞后,细胞的增殖率显著下降,凋亡率显著升高,上清的乳酸含量显著减少,并抑制低氧下HIF-lα蛋白及mRNA的表达,同时下调GLUT-1、PCNA的蛋白表达,上调p53、p21的蛋白表达。用siRNA对HIF-1α进行干预后,Rut对细胞的增殖抑制作用和乳酸含量无显著影响,而促细胞凋亡的作用显著增加。对p53、p21、GLUT-1、PCNA的干预程度无显著影响。用siRNA对GLUT-1进行基因沉默后,细胞在低氧下的增殖水平显著下降,PCNA蛋白表达减少。结论:在低氧诱导的HPASMCs中,Rut可部分通过下调HIF-lα及下游相关增殖基因GLUT-1、PCNA的表达,抑制细胞增殖;上调凋亡相关基因p53、p21的表达,促进细胞凋亡。此外,Rut还可以通过抑制HIF-1α的表达,从而抑制葡萄糖转运和糖酵解作用。