关键词:
吴茱萸水煎液
肝毒性
质量标志物
传统用法
咖啡酰葡萄糖酸异构体
摘要:
目的:随着中药应用日趋广泛和国家药物不良反应监测系统日臻完善以及人们用药安全意识的提高,药物性尤其是中药诱发肝损伤的药品不良反应报道逐渐增多。有研究表明,在我国导致药物性肝损伤的药物中,中药和草药膳食补充剂排在第一位;中药安全性已成为中医药发展战略和现代化及国际化进程中亟待解决的重要问题之一。吴茱萸是临床常用温里剂,性热,味辛、苦,有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻之功,自《名医别录》至中国药典(2015版)均记载有小毒。近年来服用吴茱萸、炮制不透的吴茱萸和过量服用致毒性反应的报道越来越多,引起了国内外同行广泛关注,大量研究表明吴茱萸有肝毒性,毒性机制可能与氧化应激有关。汤剂为吴茱萸临床主要用药形式,吴茱萸传统用法的记载多与其毒性控制有关。因此,我们提出了“基于传统用法的质量标志物(Q-marker)合理辨识”的学术思路,以吴茱萸水煎液为研究对象,传统用法为切入点,以肝毒性评价为导引,定向分离、确认吴茱萸的肝毒性物质基础,明确化学结构,并通过其可测性、传递性、专属性研究,实现吴茱萸肝毒Q-marker的合理辨识,为吴茱萸临床安全应用,源头控制肝毒性发生提供质控数据的支撑。方法:1.通过本草考证对吴茱萸毒性和传统用法的记载及两者之间的关系进行研究。2.以“久煎”为切入点,建立吴茱萸水煎液的HPLC-DAD-MS~n指纹图谱,对不同煎煮时间的吴茱萸水煎液进行指纹图谱分析,采用L02细胞的LDH、AST、ALT作为指标评价吴茱萸水煎液的肝毒性,对指纹图谱共有峰数据和肝毒性指标值进行灰色关联分析(GRA),预测肝毒性成分并进行质谱解析。3.采用高速逆流色谱(HSCCC)和制备液相对预测化合物进行分离,通过UV、MS、NMR等光谱波谱手段进行结构鉴定。4.采用HPLC-MS~n对吴茱萸水提物中目标化合物的吸收入血情况进行定性分析,采用网络药理学对目标化合物作用的靶点、通路和靶器官等进行预测。5.进行目标化合物对L02细胞的生长抑制、细胞周期影响等肝毒性验证实验。6.通过一测多评法、外标法、对吴茱萸→吴茱萸汤物质传递的研究以及文献研究,对吴茱萸肝毒物质基础进行可测性、传递性和专属性等Q-marker的性质进行研究。同时对“汤洗”的影响进行考察。结果:1.吴茱萸的传统用法可能与其毒性相关。通过本草考证发现吴茱萸在本草中多记载为“有小毒”,并在此基础上发展出了多种行之有效并延续至今的关于减毒的用法,如“久煎”和“汤洗”的传统用法。2.以“久煎”为切入点,预测了吴茱萸水煎液的肝毒性物质基础。建立了吴茱萸的HPLC指纹图谱,吴茱萸各样品之间的指纹图谱相似度为0.869-0.997,各样品的指纹图谱与对照图谱的相似度0.909-0.997,从相似度结果和指纹图谱叠加图可以看出吴茱萸样品水煎液的化学成分具有较高的一致性,表明基原和产地对吴茱萸样品水煎液的成分影响较小。吴茱萸水煎液煎煮时间在60 min时,肝毒性达到峰值,之后随着时间的延长,水煎液的肝毒性迅速下降,并基本保持持续下降的趋势。谱毒相关研究的结果将吴茱萸水煎液中可能的肝毒性成分指向了咖啡酰葡萄糖酸的异构体。3.对目标成分进行了分离和结构解析。建立了目标化合物的提取和富集方法,可快速定向的富集目标化合物,并排除大部分干扰杂质;建立了基于乙醇/正丁醇/30%硫酸铵(2﹕1﹕4,v/v)双水相体系的吴茱萸中有机酸类化合物的HSCCC分离方法;由于易氧化和分子内酯键迁移而导致的极不稳定,本论文采用了全程无氧和低温的方法保护目标化合物,成功分离得到了7个成分,通过UV、MS、NMR确定为5个咖啡酸和葡萄糖酸缩合的全系列位置异构体:3-O-反式-咖啡酰葡萄糖酸(1)、4-O-反式-咖啡酰葡萄糖酸(2)、2-O-反式-咖啡酰葡萄糖酸(3)、5-O-反式-咖啡酰葡萄糖酸(5)和6-O-反式-咖啡酰葡萄糖酸(6),以及新绿原酸(4)和绿原酸(7),其中化合物1、2、3、5为新化合物。化合物1、2、3为预测的肝毒性成分。4.对目标成分的肝毒性进行了入血分析和网络药理学预测。入血分析结果表明,吴茱萸水煎液灌胃给药后,化合物1、2、3均可以原型成分入血,可以直接作用于肝脏。根据网络药理学的预测结果,化合物1、2、3作用的36个靶点中有22个靶点在肝脏有较高的表达,说明肝脏可能是这3个化合物作用的主要靶器官之一。作用部位可能主要在细胞外基质,可能通过作用于细胞外基质影响胶原的合成与分解代谢,此外还可能通过影响药物代谢酶活性影响药物的代谢过程。5.对目标化合物的肝毒性进行了验证研究。由于化合物1、2、3的不稳定性,本论文对其相对稳定的混合物(按照水提液中的比例)进行12 h的肝毒性验证。L02细胞实验结果表明,该混合物(3.35、6.71、13.43、26.85、53.7、107.4 mg/L)作用L02细胞6 h的抑制