关键词:
吴茱萸碱
增殖
凋亡
肝癌
摘要:
目的:1.体外实验观察吴茱萸碱对人肝癌细胞株HepG2,人肝癌细胞株MHCC97H和人肝癌细胞株MHCC97L增殖能力的影响,并选取两个细胞株进一步研究吴茱萸碱对增殖、凋亡相关表型和蛋白的影响,探讨吴茱萸碱抗肿瘤增殖、凋亡的相互作用机制。2.体内实验建立HepG2肝癌细胞裸鼠皮下荷瘤模型,观察吴茱萸碱对肝癌细胞裸鼠皮下荷瘤模型肿瘤的影响,通过体内实验进一步验证吴茱萸碱对肿瘤增殖、凋亡的影响及相互作用机制。方法:1.采用吴茱萸碱浓度为 5 μ mol/mL,2.5 μ mol/mL,1.25 μ mol/mL,0.625 μmol/mL,0.3125 μ mol/mL,0.15625 μ mol/mL 和 0 μ mol/mL 作用于人肝癌细胞株HepG2、MHCC97H和HMHCC97L 24和48小时,MTT法检测吴茱萸碱对三种细胞增殖能力的影响。随后选取人肝癌细胞株HepG2、MHCC97H做后续实验。本文采用平板克隆形成实验检测吴茱萸碱对人肝癌细胞株HepG2和MHCC97H长期增殖抑制的影响。给药观察吴茱萸碱对人肝癌细胞株HepG2和MHCC97H形态学的影响。Hoechst 33342染色法检测吴茱萸碱对人肝癌细胞株HepG2和MHCC97H凋亡影响。为了进一步验证吴茱萸碱与人肝癌细胞株HepG2、MHCC97H与凋亡的相关性,本文采用流式细胞术检测吴茱萸碱对人肝癌细胞凋亡的影响,同时为了验证吴茱萸碱与人肝癌细胞株HepG2和MHCC97H增殖相关,本文采用流式细胞术检测吴茱萸碱对人肝癌细胞周期的影响。采用Western-blot法检测吴茱萸碱对细胞中Cleaved caspase3,Cleaved parp,Parp,P-erk,Erk,P-p38,P38,Bel-2,CyclinB1 和 P53 蛋白表达水平的影响。为了进一步研究吴茱萸碱对人肝癌细胞相互作用机制,本文选取人肝癌细胞株MHCC97H来探讨,根据前面的实验,本文采用Erk抑制剂U0126和P38小分子干扰RNA(Si p38 RNA)来探讨其相关作用机制,用MTT法和WB选取合适的U0126和Si p38 RNA浓度,采用Western-blot检测吴茱萸碱+U0126或者Si P38 RNA对细胞中Cleaved parp,Parp,P-erk,Erk,P-p38和P38蛋白表达水平的影响。2.将HepG2细胞接种于裸鼠右侧肋腰部皮下,建立肝癌裸鼠皮下荷瘤模型,建模成功后根据肿瘤体积随机分为三组:空白组、索拉非尼组、吴茱萸碱组,分别给予0.5%羧基纤维素纳溶液、索拉非尼(30mg/kg/d)、吴茱萸碱(30mg/kg/d)口服灌胃,每隔三天称量裸鼠体重和测量瘤体的大小,实验结束后,处死裸鼠取出皮下瘤,称量皮下瘤重量,观察各组肿瘤重量的变化,Western-blot法检测吴茱萸碱对肿瘤组织中 Cleaved parp,Parp,P-erk,Erk,P-p38,P38 和 CyclinB1 蛋白表达水平的影响,免疫组化检查吴茱萸碱对肿瘤组织中的Cleaved parp,P-erk和P-p38相关蛋白定位或定量的研究。结果:1.(1)MTT结果显示:在48h药物浓度为1.25 μmol/ml时,吴茱萸碱能显著性地抑制肝癌细胞的增殖,与空白组比较具有显著性差异(F=58.278,P=0.000;F=37.523,P=0.000;F=45.824,P=0.000),尤其是HepG2 和 MHCC97H,随着时间和剂量的增加而变化明显。其中HepG2,MHCC97H和MHCC97L 48H的IC5。分别为1.49 μ mol/ml,0.96 μ mol/ml,3.27 μ mol/ml。(2)平板克隆形成实验显示:吴茱萸碱能明显的抑制HepG2和MHCC97H细胞的长期增殖,在药物浓度为1.25 μ mol/ml时,吴茱萸碱能显著性地抑制肝癌细胞的增殖,与空白组比较具有显著性差异(F=21.686,P=0.028;F=113.869,P=0.000)。(3)在药物干预48h后,和空白组相比,药物组细胞的形态发生了明显的变化,由原来梭型、不规则形态、成团贴壁生长的细胞而逐渐皱缩、变形、细胞体积变小、细胞间的距离明显变大,且这种形态学的变化随着药物剂量的增加而更明显。(4)Hoechst 33342染色法显示:与空白组相比,随着剂量的增加,药物组发生显著的凋亡形态改变,出现明显的凋亡特征:核固缩、凋亡小体、膜空泡等,细胞核呈现碎片状,并且细胞核呈致密亮蓝色浓染。(5)流式细胞术显示:随着药物剂量的增加,药物组凋亡显著增加,在药物浓度为1.25 μ mol/ml时,吴茱萸碱能显著性地抑制人肝癌细胞的增殖,与空白组比较具有显著性差异(F=364.535,P=0.000