关键词：
山茱萸
马钱苷
化学蛋白质组学
对乙酰氨基酚
肝损伤
摘要：
山茱萸(Corni Fructus)是我国传统名贵中药材之一,具有补益肝肾、收涩固脱的功效。马钱苷作为山茱萸的主要成分之一,具有多种药理活性,如保护神经损伤、降低血糖、保护糖尿病引起的肝损伤等作用。但是其对于对乙酰氨基酚(APAP)引起的肝损伤保护作用及其机制仍有待阐明。本研究从体内和体外实验确定了山茱萸中马钱苷对APAP引起的急性肝损伤小鼠模型具有显著的保护作用,并且利用化学蛋白质组学的技术探究马钱苷保护APAP引起的肝损伤的作用机制。通过合成马钱苷分子探针,将其与活细胞人肝癌细胞系HepG2共孵育,“钓取”与马钱苷结合的靶标蛋白,利用生物素-链霉亲和素系统富集纯化蛋白质,结合基于凝胶亲和性蛋白质组学进行质谱鉴定。经过数据分析,筛选靶标蛋白,对靶点进行GO和KEGG分析。主要结果及结论如下:(1)山茱萸中马钱苷对HepG2细胞肝损伤的影响。以HepG2细胞为主要研究对象,利用800 μM H2O2刺激HepG2细胞18 h可诱导肝损伤模型,同时给予40μM和80 μM的马钱苷进行干预,观察细胞形态变化并检测细胞活力、细胞凋亡和氧化应激水平等。结果显示,对照组细胞贴壁牢固,细胞成团生长,状态良好。而在H2O2模型组细胞形态明显变化,表现为细胞膜皱缩,贴壁细胞减少,细胞碎片数量增加。在马钱苷高剂量给药组中,细胞皱缩明显减轻,贴壁较好,生长状态优于模型组。流式细胞术结果显示,H2O2模型组细胞凋亡率显著升高,马钱苷能够通过抑制凋亡保护H2O2引起的肝细胞损伤。ROS检测结果表明模型组细胞内发生了严重的氧化应激反应,马钱苷则可剂量依赖性地改善细胞内的氧化应激反应。(2)山茱萸中马钱苷对急性肝损伤小鼠的保护作用。采用APAP诱导小鼠肝损伤模型,给药组灌胃不同剂量马钱苷,观察并记录实验前后小鼠的体重变化,检测肝功指标(ALT和AST等)、肝脏氧化还原指标(SOD、GSH和CAT)、肝脏组织病理变化和肝细胞凋亡水平,运用免疫荧光检测肝细胞毒性物质CYP2E1的表达情况,结合免疫组化检测凋亡相关蛋白Bax的表达变化。结果显示:马钱苷能显著降低肝脏内转氨酶ALT和AST的水平,显著增加SOD、GSH和CAT的水平,显著降低肝细胞凋亡和毒性物质CYP2E1的表达,抑制促凋亡因子Bax的表达。(3)基于化学蛋白质组学探究山茱萸马钱苷保护对APAP引起的急性肝损伤的作用机理。在小分子马钱苷上合成端基炔,利用点击化学的方法使探针和HepG2细胞共孵育,马钱苷结合靶标蛋白后,通过探针的功能基团对已标记的蛋白进行富集和纯化,最后结合质谱等技术鉴定捕获的靶蛋白。结果显示:100 μM马钱苷探针与HepG2细胞孵育3 h显示较好的标记效果;为避免产生非特异性的标记蛋白,提前加入母体化合物作为竞争性抑制剂,结果说明合成的探针和母体化合物的靶标蛋白存在一致性;通过探针-生物素-链霉亲和素体系富集到对照组1098个蛋白,探针组496个蛋白,竞争组918个蛋白,3组重叠蛋白有403个,探针组鉴定到的特异性蛋白有34个,如CREB5、MP2K2、ATG9A等。共富集到127条通路,其中包括PI3K-Akt、HIF-1、FoxO、AMPK和Autophagy信号通路,这些信号通路均与抑制氧化应激和降低凋亡有关。综上所述,山茱萸马钱苷可以通过改善体内氧化应激和降低肝细胞凋亡等作用保护对APAP引起的小鼠肝损伤。本研究为山茱萸物质基础和核心功效的作用机制的研究提供了基础数据和理论依据,可为山茱萸药材的质量评价及控制提供新的思路和方法,同时也为山茱萸的临床应用和开发利用及产业链发展奠定基础。
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