关键词：
慢性粒细胞白血病
吴茱萸碱
TRIB2/AKT
凋亡
增殖抑制
摘要：
天然衍生化合物对寻找新的临床药物极其重要,尤其是抗癌药物。半数以上的癌症化疗药物是天然化合物及其衍生物。吴茱萸碱,由吴茱萸中分离得到,是一种具有喹唑啉骨架的著名生物碱。吴茱萸碱传统上用于治疗头痛、闭经、产后出血和胃肠道疾病。吴茱萸碱的生物活性已被广泛研究,包括抗肥胖、抗炎、抗动脉粥样硬化、神经保护、抗胃肠动力和抗增殖作用。其中,吴茱萸碱具有的多分子靶向抗增殖活性最引人关注。在包括肺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌等多种癌症中,吴茱萸碱均有良好的抗肿瘤活性。而在白血病中,EVO能通过诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期进程等方式,发挥抗肿瘤作用。实际上,在EVO抑制多种癌症的过程中,AKT发挥着极为重要的作用。AKT参与很多重要的生物学过程的调控,其通过影响下游多种效应分子的活化状态,在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用,与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关。因此,进一步阐明EVO调控AKT活性的具体机制,对EVO的临床抗肿瘤应用有着重要意义。多种生长因子、细胞因子可以通过同源受体络氨酸激酶、细胞因子受体以及脂质激酶PI3K的活化来激活AKT。PI3K将PIP2转化为PIP3。PIP3能够与AKT的PH结构域结合,随后转移至细胞膜上,被PDK1在Thr308磷酸化,PDK2再对其Ser473磷酸化,才能完全活化AKT。此外,也有报道称CDK2能使AKT在Ser477和Thr479发生磷酸化,并导致AKT进入细胞核发挥功能。总之,对于AKT来说,其酶活性主要受Thr308以及Ser473所调节。Tribbles假激酶蛋白家族由TRIB1、TRIB2和TRIB2构成,是真核生物假酶中的重要组成成员。TRIBs作为信号传导介质和支架蛋白,可导致蛋白稳定性和活性发生变化,从而影响多种肿瘤细胞过程,如增殖、分化、细胞周期和细胞凋亡。TRIB1可以和肿瘤抑制蛋白C/EBPα的泛素连接酶COP1直接结合,促进C/EBPα的降解,加速了急性髓性白血病的发生发展。TRIB2也是一种致癌蛋白,其转录受到Wnt/TCF所调控,能抑制FOXO蛋白活性,影响黑色素瘤和白血病的发生及发展。更重要的是,TRIB2被报道能与AKT形成蛋白复合物而促进其Ser473的高度磷酸化,最终诱导肿瘤细胞耐药,且TRIB2的表达水平与患者的预后相关。众多研究报道EVO可通过抑制PI3K/AKT通路诱导肿瘤细胞的凋亡,但其在白血病细胞中是否可能通过抑制AKT通路诱导细胞的凋亡,以及TRIB2在EVO抑制AKT信号通路中的具体作用尚不明确。因此,本研究将在体内外探究EVO对白血病细胞凋亡的影响以及AKT发挥的具体作用,并初步剖析TRIB2在EVO调控AKT活性中扮演的角色。目的本研究第一部分以人白血病（Leukemia）细胞株K562为研究对象,在裸鼠皮下成瘤模型中检测EVO对于K562细胞生长的影响,并在体外观察EVO对于K562细胞凋亡的影响;第二部分深入探究EVO诱导K562细胞凋亡的潜在机制。方法第一部分:在BALB/c裸鼠的皮下注射K562细胞,建立裸鼠瘤体生长模型,使用不同剂量的EVO进行灌胃处理,记录小鼠体重、瘤体体积,实验结束后,测量瘤体重量,使用Tunel染色法检测瘤体细胞凋亡水平。在体外实验中,使用CCK-8法检测不同浓度EVO对K562细胞增殖的影响,使用流式细胞术法检测EVO对K562细胞凋亡的影响。第二部分:使用Western-blot法检测EVO对于K562细胞中TRIB2、AKT、p-AKT、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase 3、Bcl-2等蛋白的表达;运用RT-PCR方法检测TRIB2的m RNA表达;以EVO作用于AKT激活剂SC79预处理后的K562细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测TRIB2、AKT、p-AKT、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase 3、Bcl-2等蛋白的表达。以siRNA抑制TRIB2转录因子TCF4的表达后,Western blot检测TRIB2、AKT、p-AKT、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65等蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡。以EVO作用于Wnt激活剂SKL2001预处理后的K562细胞,Western blot检测TRIB2、AKT、p-AKT的表达。结果第一部分1.小鼠体重记录显示:对照组与低剂量EVO组（10 mg/Kg）、高剂量EVO组（20 mg/Kg）三组之间,小鼠体重无统计学差异;2.瘤体体积记录显示:EVO组的瘤体体积明显小于对照组,且高剂量的EVO组的瘤体体积更小;3.瘤体重量记录显示:低剂量与高剂量组的瘤体重量均显著低于对照组;***
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