关键词:
山茱萸
多糖
结构
动脉粥样硬化
巨噬细胞
摘要:
动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种以动脉壁脂质沉积和斑块形成为主要特征的慢性炎症性疾病,可引起缺血性心脏病和周围血管疾病等重大疾病。目前用于预防或治疗AS的药物疗效有限,且复发现象时有发生。因此,研究人员越来越多地致力于从天然资源中开发抗AS的药物。多糖作为存在于植物、动物和微生物内的主要大分子之一,不仅是生物体内的能量资源和成分物质,而且具有多种多样的药理活性,特别是治疗AS的作用引起广泛的关注。中药山茱萸(Cornus officinalis *** Zucc.)可用于滋养肝脏和肾脏。研究表明,山茱萸中的活性成分具有一定改善脂质代谢的作用,但山茱萸多糖的结构以及抗AS的研究较少。本课题通过分离纯化得到3种均一性山茱萸多糖,并对其理化性质和结构进行研究,进而采用体内外模型对山茱萸多糖的抗AS活性进行初步评价,为进一步开发利用山茱萸多糖提供了理论基础。方法:1.本研究通过碱提醇沉、Sevag法除蛋白、过氧化氢法除色素后制备得到山茱萸总多糖(PFC),进而采用离子交换柱和葡聚糖凝胶柱分离纯化得到3种山茱萸多糖PFC-1、PFC-2和PFC-3。尺寸排阻色谱法测定3种山茱萸多糖的均一性和分子量。对3种山茱萸均一性多糖中的糖含量、糖醛酸含量以及蛋白质含量,分别采用苯酚硫酸法、硫酸咔唑法和考马斯亮蓝法进行测定。红外光谱(FT-IR)鉴别多糖的特征性官能团。2.运用高效液相色谱法测定3种山茱萸均一性多糖的单糖组成;甲基化和气质联用仪分析糖苷键的连接类型;一维和二维核磁共振(NMR)分析糖苷键的连接方式。3.构建Apo E-/-小鼠AS体内模型,初步探究山茱萸多糖对AS的治疗作用,采用伊红苏木素染色和油红O染色检测AS斑块形成水平、酶法检测血清脂质水平和抗氧化酶活性。免疫组化及天狼猩红染色检测斑块中巨噬细胞、平滑肌细胞含量和胶原纤维含量,进一步分析斑块稳定性。构建氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导RAW264.7巨噬细胞泡沫化体外模型,油红O染色法检测山茱萸多糖抑制巨噬细胞泡沫化水平。结果:1.分离纯化得到3种均一性山茱萸多糖PFC-1、PFC-2和PFC-3,分子量分别为1.2×103、6.3×104和4.7×104 Da。它们的总糖含量分别为93.1%、60.6%、51.3%;糖醛酸含量分别为3.0%、33.3%、46.7%;蛋白质含量分别为0.1%、0.1%、0.1%。FT-IR结果说明3种均一性多糖都具有多糖的特征吸收峰;其中PFC-2和PFC-3具有糖醛酸的特征吸收峰。***-1主要由Man、Glc、Gal和Ara组成,摩尔比为1.00∶2.96∶6.25∶2.08;甲基化结果显示,组成PFC-1的主要糖残基类型及摩尔比为1,2-Araf、1,6-Manp、T-Galp、1,3-Galp和1,6-Glcp(1.19∶1.00∶2.39∶4.41∶2.85)。PFC-2的单糖组成为Man、Rha、Gal A、Glc、Gal和Ara,摩尔比为1.04∶8.41∶5.31∶1.00∶7.76∶25.84;主要的糖残基类型及摩尔比为T-Araf、1,3-Araf、T-Galp、2,3-Araf、1,2-Rhap、1,4-Galp、2,3,4-Araf、1,2,6-Glcp、1,3-Galp、2,4-Manp(2.71∶1.41∶1.15∶1.00∶1.96∶3.75∶1.23∶0.16∶0.77∶1.73)。PFC-3由Man、Rha、Gal A、Glc、Gal和Ara组成,摩尔比为1.45∶5.44∶32.70∶1.00∶2.92∶10.76。主要的糖残基类型及摩尔比为T-Araf、1,3-Araf、T-Galp、2,3-Araf、1,2-Rhap、1,4-Galp、1,6-Glcp、1,3-Galp、1,6-Galp和2,3,4-Manp(4.74∶6.04∶2.60∶1.00∶2.87∶15.93∶3.04∶0.51∶0.85∶0.39)。PFC-2和PFC-3部分酸水解分析结果显示,PFC-2的部分酸水解产物由Rha、Gal A和Gal组成,摩尔比为1.53∶2.34∶1.00。主要糖残基类型及摩尔比为T-Galp、1,2-Rhap、1,4-Galp和1,3-Galp(1.00∶1.63∶1.58∶1.06)。PFC-3的部分酸水解产物由Rha、Gal A和Gal组成,摩尔比为1.23∶14.51∶1.00。主要糖残基类型及摩尔比为1,2-Rhap、1,4-Galp、1,3-Galp和1,6-Galp(1.16∶13.38∶1.90∶1.00)3.体内实验表明,PFC显著抑制高脂饲料喂养的Apo E-/-小鼠AS斑块的形成,PFC处理组中血清的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和总胆固醇(TC