关键词:
吴茱萸
枯萎病
藤仓镰刀菌
多粘类芽孢杆菌
发酵条件
摘要:
吴茱萸(Tetradium ruticarpum),系芸香科(Rutaceae)吴茱萸属(Tetradium)小乔木,是我国传统中药植物,以干燥近成熟果实入药,收录于《中华人民共和国药典》。吴茱萸提取物中的吴茱萸碱、吴茱萸次碱及柠檬苦素作为《中华人民共和国药典》中规定衡量吴茱萸有效药用成分的重要指标,具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、保肝、抗阿尔茨海默症、降血糖及降血脂等作用。2023年7月-2024年9月,在重庆万州龙驹镇吴茱萸种植基地内,发现了吴茱萸枯萎病,该病造成吴茱萸叶片枯死,严重影响种植户收入及吴茱萸产业可持续发展。
本研究通过采集典型发病症状的植株叶片分离、纯化菌株,并进行致病性测定、利用形态学特征和分子生物学分析相结合对病原菌进行鉴定,明确吴茱萸此新病害病原菌种类;通过病原菌生物学特性研究,明确最适宜菌丝生长、产孢的条件;通过致病菌侵染过程研究,明确该病害的侵染特点、发生发展规律;通过室内毒力测定试验,筛选出防治效果最佳的化学农药和生物农药;通过生防菌的筛选,筛选到对致病菌具有良好抑制作用的生防菌并进行培养条件优化及室内毒力测定。主要研究结果如下:
1.吴茱萸枯萎病田间发病情况:该病害初期在吴茱萸叶片上形成黑棕色不规则斑点,后扩展成片,蔓延至茎节及芽,造成茎节基部干枯发黑、芽枯死,枝条萎蔫,严重时茎秆及其上叶片全部枯死变黑,呈卷曲状。始发于7月,8-9月为发病高峰期,发病率达38%,病情指数约为28。
2.病原菌鉴定:结合形态学特征及基于ITS、EF-1a和RPB2多基因联合分析,确定引起万州吴茱萸枯萎病的病原菌为藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi),这是***引起吴茱萸枯萎病的首次报道。
3.病原菌生物学特性研究:BA培养基,碳源为葡萄糖,氮源为牛肉膏或酵母粉,28℃,p H 7.0,光暗交替或全黑暗条件下最利于***生长;PDA培养基,碳源为葡萄糖,氮源为牛肉膏,28℃,p H 7.0,全黑暗条件下最利于***产孢。
4.侵染过程:***以菌丝作为主要侵染结构,通过气孔及叶片绒毛基部侵入吴茱萸叶片,导致局部细胞的死亡产生病斑,最终堵塞维管束造成枝枯。其对吴茱萸叶片致病力极强,更易侵染老叶,高温与长期高湿环境是该病害流行的关键条件。
5.室内毒力测定:5种化学杀菌剂中,对***抑制效果最好的是25%啶菌噁唑乳油,EC50为0.415μg/m L;6种生物药剂中,1%申嗪霉素悬浮剂和0.3%四霉素水剂对***抑制效果最好,EC50值分别为0.0070μg/m L和0.0074μg/m L,该研究结果为生产上有效防控由***引起的吴茱萸枯萎病提供科学依据。
6.盆栽试验:25%啶菌噁唑乳油500倍液和1%申嗪霉素悬浮剂500倍液对由***引起的吴茱萸枯萎病的防效最佳,分别为50.81%和49.53%,且两种药剂的使用对吴茱萸生长均未造成影响,可作为防治该病害的优选药剂。
7.生防菌筛选与发酵条件优化:通过平板对峙法从吴茱萸根际土壤中分离得到一株对***拮抗效果强的菌株D-4,结合形态学特征、生理生化试验和16S r DNA基因分析,确定菌株D-4为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。该菌株具备广谱抑菌活性,在吴茱萸枯萎病的生物防治方面具有极高的开发潜力。通过单因素试验法,明确*** D-4最适碳源为蔗糖,最适氮源为尿素,最适无机盐为Ca Cl2,最适发酵条件为40%装液量,1%接种量,初始p H值9.0,温度32℃,培养20h。通过室内毒力试验测定*** D-4发酵液的生防效果,发现其对*** W2的菌丝生长抑制效果显著,优于枯草芽孢杆菌商品菌株,其EC50值为1.7330×10~3CFU/m L。