关键词：
动脉粥样硬化
吴茱萸碱
AMPK
自噬
摘要：
目的:冠心病（coronary heart disease;CHD）是人类非常常见的心脏病,极易诱发心源性猝死。在法律上,心源性猝死属于自然死亡,然而介于其常发生于各种外力诱因之后,常常被怀疑为非正常死亡,进而引起争议,产生法律纠纷。因此如何准确、快速的鉴别心源性猝死是法医相关工作的研究重点。有研究表明心源性猝死的重要病理基础为冠状动脉粥样硬化（atherosclerosis;AS）的形成,其斑块的稳定性与心源性猝死的发病存在明显的相关性,因此,彻底的探究动脉粥样硬化的发病机制,寻找有效的防治手段,减少此类患者的猝死几率,对减轻法医临床相关鉴定工作具有较大的帮助。
常规的治疗动脉粥样硬化的手段是西药治疗或者手术治疗,然而这种治疗手段均会引起相关副作用,在这方面,中药体现出了极大的优势。近年来研究表明,动脉粥样硬化与自噬关系密切,通过上调自噬,能够提高细胞的脂质外排,降低细胞内脂质,减缓泡沫细胞形成,从而改善动脉粥样硬化。因此以激活自噬作为治疗动脉粥样硬化的治疗靶点成为目前的研究热点。
自噬的激活通路有很多,其中AMPK信号通路是最主要也是最常见的,因此,干预AMPK信号通路是激活自噬的最佳手段,有学者研究表明,吴茱萸碱（evodiamine;EVO）在众多疾病中均能够明显的激活AMPK信号通路,这成为我们关注的重点。
经过查阅相关文献,对相关知识进行归纳总结,并对科学问题提出合理的假说和提炼,并且前期的工作结果提示吴茱萸碱能够明显的改善Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成。因此,本课题拟解决的科学问题是:通过一系列的技术手段及体内外实验证明,EVO通过调节AMPK活性,进而激活自噬,从而对AS具有一定的防治作用。
方法:1)体内实验:选择6-8周的Apo E-/-小鼠喂养高胆固醇饮食12周,同时给予EVO（3mg/Kg）灌胃治疗（每天一次）,处死后,取血清、心脏、血管等组织冻存备用。血管切片,油红O观察AS斑块形成情况;测定血清中胆固醇酯（cholesteryl ester;CE）及游离胆固醇（free cholesterol;FC）水平;H.E.染色观察血管根部AS内坏死中心面积;通过Masson、小天狼星红染色观察斑块内胶原纤维含量;Tunel染色观察细胞凋亡;IHC检测P62、LC3、p-AMPK等蛋白的表达;荧光染色后共聚焦观察斑块内F4/80与LC3的表达及共定位情况;2)体外实验:培养小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞株,分别加入吴茱萸碱0、0.5、1、2、4、8、16、32μmol·L-1继续培养24 h,CCK-8法检测吴茱萸碱对RAW 264.7生存活性的影响,选取不影响增殖前提下的最高浓度,为后续实验给药浓度。EVO处理合并LDL处理24h,观察细胞内炎症因子相关蛋白m RNA及蛋白水平;油红O染色观察细胞内脂质沉积;MDC染色观察细自噬小泡的量;自噬流检测细胞内自噬过程的改变;Western blot检测自噬及激活信号通路等蛋白的表达含量;细胞EVO处理合并AMPK抑制剂compound C（CC）处理后,检测自噬相关蛋白表达水平改变、自噬小泡的改变以及LDL Loading后细胞内脂质积聚的改变。
结果:***处理组AS的面积明显减小,同时斑块内坏死中心减少,且斑块内的胶原生成明显增多,结果表明EVO组较对照组拥有较小的、更稳定的动脉粥样硬化斑块。
2.结果表明,EVO能够上调细胞内自噬的水平,与体外实验吻合。
***处理细胞后,AMPK活性明显增高,推测EVO处理激活AMPK活性进而激活自噬。
4.体外数据显示,加入CC后,EVO处理不能激活自噬以及改善巨噬细胞内脂质的积聚,表明EVO对自噬的激活作用是通过AMPK的激活完成的。
结论:在EVO处理后能通过减少细胞内炎症、改善APMK活性进而激活自噬,改善巨噬细胞内脂质积聚,阻止泡沫细胞生成从而达到改善AS的作用。
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