关键词:
吴茱萸碱
子宫内膜异位症
异位子宫内膜间质细胞
缺氧诱导因子-1α
低氧刺激
增殖与凋亡
摘要:
子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)是指具有活性的子宫内膜细胞附着在子宫腔以外的部位,在低氧微环境中发生、发展,被称为良性类肿瘤疾病。低氧主要受到缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的调节,在EMs中表达程度较高,并随着病程发展不断上调,被认为是EMs治疗的潜在靶点。现代药理学研究提示,吴茱萸碱(Evodiamine,Evo)可在低氧条件下加速HIF-1α的降解,破坏肿瘤生存的低氧微环境,发挥抗肿瘤的药理作用。但目前尚未有研究表明Evo可以通过调控HIF-1α表达,改善EMs所处的低氧微环境,在治疗中发挥潜在应用价值。
综上所述,本研究将通过体外细胞实验和动物体内实验两部分,探究Evo对EMs的治疗作用及可能机制。
第一部分探究不同含氧微环境中吴茱萸碱对子宫内膜异位症患者异位内膜间质细胞增殖、凋亡及HIF-1α表达的作用
目的:探究Evo对EMs患者异位内膜间质细胞(Endometrial stromal cells,ESCs)的影响,分析暴露于常氧、低氧环境中Evo对细胞增殖、凋亡及HIF-1α表达量变化的差异,以期初步明确Evo对异位ESCs增殖凋亡特性的影响与HIF-1α调控的关系。
方法:分离培养原代异位ESCs,设置空白对照(Control)组及Evo不同剂量组,采用MTT比色法检测常氧环境下Evo各组(2.5、5、10、20、40、80μmol/L)在不同时间(24h、48h、72h)内细胞存活率,分析量效关系,筛选后续实验使用剂量;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、蛋白印迹(Western blot)技术分别检测常氧环境下Evo各剂量组(2.5、5、10、20、40μmol/L)孵育异位ESCs 48h对细胞中HIF-1αm RNA、HIF-1α蛋白表达量的影响;Western blot技术检测常氧环境下Evo各剂量组(2.5、5、10、20、40μmol/L)孵育细胞48h后凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)表达情况;采用流式细胞术检测暴露于Evo各剂量组(2.5、5、10、20、40μmol/L)48h对细胞凋亡情况的影响。
在低氧刺激下进一步探究Evo对异位ESCs增殖、凋亡及HIF-1α表达的影响:确定CoCl2构建低氧刺激的条件,检测不同剂量Evo(2.5、5、10、20、40、80μmol/L)孵育细胞24h、48h的存活率;依据MTT检测结果,选定后续实验Evo使用剂量(2.5、5、10、20、40μmol/L)及孵育时间(24h)检测异位ESCs中HIF-1α表达量,以及Bax、Bcl-2蛋白表达情况,分析比较不同含氧微环境中药物对细胞作用的异同。
结果:
1.观察Evo在常氧环境下的抑制增殖作用,筛选实验条件
MTT比色法检测常氧环境下Evo各组中异位ESCs存活率,发现Evo各剂量(2.5、5、10、20、40、80μmol/L)组细胞存活率均低于Control组,存活率随浓度升高而降低,呈明显的量-效关系;相同浓度Evo处理细胞不同时间(24、48、72h)后,存活率随处理时间的增加而降低,呈明显的时-效关系。通过分析比较并初步筛选出应用于后续实验的剂量(2.5、5、10、20、40μmol/L)以及作用时间(48h)。
***在常氧环境下影响HIF-1α表达
通过qRT-PCR及Western blot技术对细胞中HIF-1α表达情况进行检测,结果表明常氧下,与Control组相比,5、10、20、40μmol/L Evo可以显著降低细胞中HIF-1αm RNA及蛋白表达量(P<0.05,P<0.01)。
***在常氧环境下促进凋亡相关蛋白表达,诱导细胞凋亡
分析常氧下Bcl-2/Bax表达结果,发现与Control组相比,2.5、5、10、20、40μmol/L Evo可以显著促进促凋亡蛋白Bax表达(P<0.05,P<0.01);5、10、20、40μmol/L Evo可显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达(P<0.05,P<0.01);Evo各剂量组均可降低Bcl-2/Bax比值(P<0.05,P<0.01)。
常氧下流式细胞术检测结果表明,与Control组相比,10、20、40μmol/L Evo各组中Q2、Q4象限凋亡细胞团块明显增多,凋亡率显著升高(P<0.01)。
4.确定CoCl2构建低氧刺激的条件,观察Evo抑制细胞增殖作用
选用25μmol/L CoCl2孵育异位ESCs 24h,在常氧环境实验基础上,进一步分析低氧刺激下Evo各剂量组对异位ESCs存活率的影响,结果表明,与CoCl2组相比,2.5、5、10、20、40、80μmol/L Evo孵育细胞24h、48h,均可显著抑制细胞增殖(P<0.01)