关键词：
吴茱萸
甘草炮制
肝毒性
减毒机理
物质基础
摘要：
【目的】通过系统比较吴茱萸和甘草制吴茱萸不同提取物各组分的变化规律、对比药动学特征的差异,阐述减毒的物质基础;分析炮制前后不同提取物的肝毒性差异和体内小分子代谢物的代谢轮廓差异,验证甘草炮制减毒的科学性;整合毒理学、药动学和代谢组学数据,整体阐明甘草制吴茱萸减毒的作用机制。【方法】1.以吴茱萸碱、吴茱萸次碱、甘草苷和柠檬苦素为评价指标,采用中心组合-响应曲面法研究甘草汁与吴茱萸的比例、炒制温度和炒制时间等因素对甘草制吴茱萸的影响,确定最优炮制工艺。2.采用HPLC、HPLC-QTOF-MS和GC-MS指纹图谱定性与多指标定量方法,对吴茱萸和制吴茱萸的醇提物、水提物和挥发油进行全成分分析,比较甘草炮制前后各提取物的成分差异,追踪炮制前后的组分变化规律,明确炮制减毒的物质基础。3.采用灌服冰知母的方法建立了大鼠胃实寒证模型,对吴茱萸甘草炮制前后的三种提取物（醇提物、水提物和挥发油）、三个不同剂量组的急性肝毒性进行系统比较。评价指标与方法包括:一般行为和肝体重比,血清酶（SOD,MDA,ALT和AST）,线粒体ATP酶和炎症因子（TNF-α,IL-1β和IL-6）的生化检测,蛋白表达（Bax,Bcl-2和Caspase3蛋白）和组织形态学分析。明确不同提取物的毒性大小及炮制对各提取物毒性的影响。4.建立大鼠血浆中吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸卡品碱和吴茱萸二氢卡品碱的UPLC-MS-MS分析方法,并将其应用于大鼠灌服吴茱萸生品及甘草制品提取物的药动学研究。采用药代动力学分析软件DAS 3.1拟合各化合物的药代动力学参数,并对炮制前后的各参数进行比较,从体内药动学角度阐述甘草炮制减毒的物质基础。5.基于UPLC-LTQ-Orbitrap/MS技术对胃实寒证大鼠的血浆、肝脏、粪便和尿液代谢轮廓差异进行分析,找出吴茱萸肝毒性的潜在生物标志物及其相关的富集通路,并通过代谢通路归属分析探讨吴茱萸经甘草炮制减毒的整体作用机制。【结果】1.确定甘草汁的制备方法为:甘草药材剪断成1-2cm的段状浸泡后加热回流提取三次,将滤液浓缩成浸膏,临用前加水稀释成含量为0.06g/m L的甘草汁。确定甘草制吴茱萸最佳炮制参数为:吴茱萸与甘草汁用量比为1:1（质量体积比）,闷润时间为6小时,炒制温度120±10℃,炒制时间20min。2.吴茱萸经甘草汁炮制后增加了甘草苷、甘草酸、甘草次酸等甘草中的主要药效成分;炮制后有机酸含量下降超过50%;炮制后挥发油总量为炮制前的42.8%,肝毒性成分α-蒎烯和芳樟醇含量大幅减少（α-蒎烯含量是炮制前的23.6%、芳樟醇是炮制前的41.1%）。炮制后挥发油总量的减少及肝毒性成分α-蒎烯和芳樟醇含量的减少、有机酸含量的大幅降低及炮制过程中增加的甘草成分是炮制减毒的物质基础。3.建立的胃实寒证模型可很好地模拟人体内的胃实寒证,适用于吴茱萸和制吴茱萸的肝毒性研究。根据一般行为和生化指标分析、细胞凋亡蛋白表达的WB分析和组织病理学检查发现,吴茱萸三种提取物的高剂量组都会造成显著肝损伤,三者肝损伤大小依次为水提物>醇提物>挥发油。炮制后各提取物的肝损伤均有得到显著缓解,其中制吴茱萸挥发油各组肝损伤已与对照组无显著差异,因此经甘草炮制后,吴茱萸的急性肝毒性可得到明显减轻,减轻的原因可能在于甘草炮制可以减轻对肝组织的过氧化应激损害,调节肝脏能量代谢,降低了与炎症释放相关的指标、调节了Bcl-2、Bax和Caspase3这三个蛋白的表达。另一方面,炮制后毒性的降低也可能跟甘草的拮抗作用有关。4.建立的UPLC-MS-MS方法可同步定量分析大鼠血浆中的吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸卡品碱和二氢吴茱萸卡品碱四种活性成分,其选择性、线性范围、回收率、基质效果、精密度、稳定性等均符合生物分析试验要求。通过比较吴茱萸生药材和甘草制吴茱萸醇提物在大鼠血浆中的药代动力学各参数,发现炮制后吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸卡品碱和二氢吴茱萸卡品碱的药时曲线下面积和半衰期均有显著提高,吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸卡品碱的Tmax有显著降低(二氢吴茱萸卡品碱Tmax变化不大),表明炮制增强了四种成分的药效作用。5.通过对胃实寒症大鼠的血浆、肝脏、粪便和尿液的代谢物轮廓进行对比分析,结果表明:（1）吴茱萸能引起大鼠体内代谢物的紊乱,在血浆筛选出10种、肝脏15种、尿液9种、粪便14种差异代谢物。（2）吴茱萸导致丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸的合成、甘油磷脂代谢和初级胆汁酸生物合成等代谢通路的紊乱,这是吴茱萸致急性肝损害的机理。（3）甘草制吴茱萸大剂量使用也会造成一定程度的肝损伤,但损伤程度减轻很多,甘草炮制保护肝脏的机理可能是调节丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸的合成和甘油磷脂代谢,但对胆汁酸合成的紊乱作用不明显。6.遵从药典剂量使用
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