关键词:
吴茱萸
甘草
配伍
P450酶
吴茱萸碱
肝毒性
代谢活化
摘要:
细胞色素P450酶(P450酶)是最常见和重要的Ⅰ相代谢酶,参与临床约75%的药物的氧化代谢。传统中药吴茱萸(Euodiae Fructus)临床应用广泛,但被报道可致肝毒性。吴茱萸碱(Evodiamine,EVD)作为其主要肝毒性成分之一,可能在P450酶介导下被生物转化为亲电反应性代谢物,称为代谢活化。然而,EVD诱导的肝毒性与其代谢活化之间的关系尚不明确。此外,甘草(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma)常与吴茱萸配伍使用,但是否存在减毒作用及其在药物代谢角度的作用机制尚未报道。为了解决以上两方面关键问题,本课题包括以下研究内容:
1.首先对EVD的肝脏毒性进行了综合评价,分别考察了EVD引发肝毒性的时间、剂量依赖性作用。KM小鼠单次腹腔注射100 mg/kg EVD后,分别在0,12,24,36 h观察EVD对肝脏的影响,结果显示从给药后12 h开始脏体比与血清ALT、AST水平均显著升高,并且在24 h时肝功能指标达到峰值。分别给药不同剂量EVD(50,100,200mg/kg)后,小鼠的脏体比和血清生化指标随着给药剂量的增加而呈升高趋势,具有明显的剂量依赖性。病理组织切片显示,给药200 mg/kg 24h时,肝细胞水肿明显,细胞体积增大,提示EVD有明显的肝毒性。
2.利用兼具定性分析和结构鉴定功能优势的UPLC-Q/TOF-MS/MS技术和Mass Lynx数据分析研究EVD体内外代谢活化过程,并明确参与其代谢活化的主要酶亚型。采用大鼠肝微粒体(Rat liver microsome,RLM)和人重组酶体外孵化的方法,加入谷胱甘肽(Glutathione,GSH)作为捕获剂,检测EVD的反应性代谢产物,我们检测到了两种来自EVD反应性代谢物与GSH的结合物(GM1和GM2)。并且通过在RLM中加入各P450酶亚型的特异性抑制剂及重组酶孵化体系,发现CYP3A4是参与EVD的代谢活化的主要代谢酶。此外,在EVD给药后的小鼠尿液中检测到GM2降解产生的N-乙酰-L-半胱氨酸结合物,并且首次在EVD给药的大鼠胆汁中发现了亚氨基醌代谢中间体。
3.本章实验内容通过抑制CYP3A4研究EVD代谢活化与其引发肝毒性的相关性。CYP3A4特异性抑制剂酮康唑(Ketoconazole,KTC)与EVD联用使小鼠血清中的ALT、AST水平显著性降低,并且肝细胞水肿减轻、cleaved caspase-1、cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表达降低。丁硫氨酸亚砜亚胺(L-Buthionine-sulfoximine,BSO)可以抑制γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶进而减少GSH的合成,由于消耗了GSH,在使用BSO预处理实验动物后加重EVD诱导的肝毒性。毒代动力学研究发现KTC+EVD联用组动物血浆中EVD的AUC显著升高,即KTC显著增加了EVD的血药浓度,显著延长其半衰期。综上所述,CYP3A4介导的代谢活化是EVD引起的肝毒性的主要原因,但是EVD本身并不能诱导肝毒性,而是由CYP3A4催化产生的反应性代谢产物引起的肝损伤。
4.吴茱萸作为“小毒”中药常与甘草配伍使用,本章比较了甘草配伍吴茱萸与吴茱萸单独给药对肝脏影响的差异性及血清中EVD的相对含量。连续给药吴茱萸(9.0 g/kg/d)20天,发现雄性SD大鼠出现了一定的肝脏损伤,与吴茱萸单独给药组相比,甘草配伍吴茱萸组在第10天ALT、AST水平显著性降低,这提示甘草可以在一定程度上减轻吴茱萸引起的肝损伤。此外,从给药第10天开始,配伍给药组大鼠血清中EVD的相对含量升高,但是该组的肝损伤开始减轻,一方面说明吴茱萸引发的肝毒性很可能与其毒性成分在体内发生代谢活化相关,另一方面揭示了甘草可以抑制其毒性成分的代谢活化从而达到减毒的效果。
5.为了进一步明确甘草配伍吴茱萸的减毒机理,本章采用UPLC-QQQ-MS/MS技术建立了检测各主要P450酶亚型活性的快速灵敏的分析平台。首先利用该分析平台对甘草中的6个主要成分进行筛查,在人肝微粒体(Human liver microsome,HLM)及CYP3A4重组酶的孵育体系中均发现异甘草素(Isoliquiritigen,ILG)对CYP3A4的抑制作用较强,并通过分子对接实验证明ILG与CYP3A4可以相互作用。通过对ILG引起CYP3A4失活作用的类型和机制进行进一步的研究发现ILG使CYP3A4产生失活具有时间、浓度、NADPH依赖性。酶动力学研究测得酶动力学参数kinact和KI分别为0.066 min-1和0.93μM。一般采用kinact/KI综合评价ILG使CYP3A4失活的效率,即71.0 min-1·m M-1,P值为428。硝苯地平作为CYP3A4的经典底物在2