关键词:
恶性黑色素瘤
吴茱萸碱
PD-L1
PI3K/AKT信号通路
摘要:
背景:恶性黑色素瘤(Malignant melanoma)具有恶性度高、侵袭性强、易转移等特点,近年来应用抑制剂靶向程序性死亡受体-1(PD-1)与其配体PD-L1结合的免疫疗法成为黑色素瘤的治疗热点。PD-1是一种跨膜免疫球蛋白,它主要表达于T细胞表面,当其与肿瘤细胞表面表达的PD-L1结合时,不仅会出现T细胞活化的抑制作用,甚至还会诱导T细胞凋亡,从而减弱机体免疫系统的抗肿瘤效应,促使肿瘤免疫逃逸发生。我国传统中草药提取物吴茱萸碱(Evodiamine,EVO),已被证实对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用,但EVO的抗肿瘤免疫作用尚未受到关注。大量研究证实EVO可调控PI3K/AKT信号通路,而PD-L1的表达受PI3K/AKT信号通路调节。目的:研究EVO对小鼠黑色素瘤的抑制作用以及对PD-L1表达的影响,探讨PI3K/AKT信号通路在其中发挥的作用,为黑色素瘤的免疫治疗提供新的思路。方法:1.使用浓度为2μM、4μM、6μM的EVO作用于小鼠黑色素瘤B16-F10细胞,通过CCK-8、平板克隆、Annexin V-FITC/PI、Transwell和伤口愈合实验评价EVO对B16-F10细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的影响。2.通过在C57BL/6小鼠背部皮下注射B16-F10细胞建立黑色素瘤同种皮下移植瘤模型。模型成功建立后,对小鼠进行分组,分别为未建模的健康小鼠Control组、给予EVO处理的成瘤小鼠EVO组和使用生理盐水对照的成瘤小鼠Model组。观察小鼠的生存状态、瘤体增长和脾脏体积的变化;HE染色观察肿瘤细胞及脾脏的组织病理变化;通过流式细胞术检测小鼠脾脏及骨髓中T细胞亚群浸润比例,观察EVO对小鼠体内免疫细胞的影响;免疫组织化学检测进一步验证瘤体及脾脏中T细胞的浸润;通过对小鼠体内重要脏器组织(心、肝、肺、肾)进行HE染色观察其组织病理学变化,评价EVO在体内的生物安全性。3.通过qRT-PCR、Western Blot实验研究EVO处理后的B16-F10细胞以及皮下移植瘤中PD-L1的表达。Western Blot实验观察PI3K/AKT信号通路及其相关因子的变化。结果:***-8、平板克隆、Annexin V-FITC/PI、Transwell和伤口愈合实验结果表明,EVO作用于小鼠黑色素瘤细胞B16-F10细胞后,能够明显抑制其增殖能力,以及侵袭、迁移能力,同时促进其凋亡能力(P<0.05)。2.使用EVO对黑色素瘤同种皮下移植瘤小鼠进行治疗后,能够显著抑制小鼠瘤体组织的体积及质量(P<0.001);HE结果显示Model组肿瘤细胞形态各异,异型性明显,核分裂象多,核浆比例增大;EVO组肿瘤细胞的核分裂象少,核浆比例降低。***可显著抑制黑色素瘤荷瘤小鼠脾脏系数(P<0.01);HE结果显示EVO组小鼠脾脏白髓与红髓边缘分界清晰,结构规整,且白髓内可见密集淋巴细胞浸润;流式细胞术结果表明,EVO组小鼠骨髓中的CD4+和CD8+T细胞及脾脏中的CD4+T细胞较Model组明显升高(P<0.05);免疫组织化学结果亦显示EVO组小鼠脾脏及瘤体组织中CD4和CD8阳性表达强于Model组(P<0.05);HE结果显示EVO组与Control组正常小鼠相比,两组小鼠各脏器均结构完整,边缘清晰,镜下未见组织变性、坏死及其他明显的病理变化。***-PCR、Western Blot及免疫组化实验结果显示,经EVO处理后的B16-F10细胞及移植瘤中的PD-L1表达较Model组均显著降低(P<0.01);PI3K/AKT信号通路中相关分子P-PI3K、P-AKT在EVO组中的表达均降低(P<0.05);使用AKT激动剂SC79和EVO联合处理B16-F10细胞后,其P-PI3K、P-AKT、PD-L1的表达相较仅使用EVO处理的细胞均升高(P<0.05)。结论:EVO能显著抑制小鼠黑色素瘤的生长,可能是通过调控PI3K/AKT信号通路抑制PD-L1的表达,从而改善肿瘤免疫微环境发挥的抗肿瘤作用。