关键词:
乳腺癌
吴茱萸次碱
miR-149-3p
S100A4
自噬
血管生成
摘要:
研究背景乳腺癌是全世界妇女中最常见的恶性肿瘤。近年来,随着人口老龄化的加速,工业化、城市化及生活方式的改变,女性乳腺癌疾病负担日益加重。提高早期乳腺癌的检出率并进行及时有效的治疗是降低乳腺癌死亡率的有效措施。目前,大多数抗癌药物对正常乳腺细胞具有毒性,传统的中医治疗主要强调以平衡阴阳为目标,从而治疗和提高身体内部的免疫能力。在某种程度上,中医在治疗乳腺癌方面具有现代医学所不具备的优势。吴茱萸次碱(Rutaecarpin,RUT),一种从吴茱萸果实中分离出来的生物碱,已被报道具有抗炎、抗血栓和心血管保护作用。此外,RUT可通过多种分子机制抑制癌细胞增殖、并诱导凋亡。然而,RUT对乳腺癌相关生物功能的作用和机制尚不清楚。MicroRNAs(miRNAs)是一种大小约为22个核苷酸的小型非编码RNA(ncRNA),在基因调控中发挥着重要作用。据报道,miRNAs在多种癌细胞的生物过程中起关键作用。如细胞增殖、转移、血管生成、凋亡、自噬等。miR-149-3p作为一种抑癌基因,可阻止多种癌症进程。有研究表明,RUT可上调p53,p53又可正向调控miR-149-3p,进而恢复结直肠癌的化学敏感性。然而,RUT是否可影响miR-149-3p表达尚不清楚。另外,miRNA可调控的靶基因众多,目前尚不清楚miR-149-3p在乳腺癌细胞中可能调控的靶基因。通过生物信息学分析,我们发现miR-149-3p 与多个基因的启动子区(如 S100A4、C20orf96、GNAT1、FOXP4、LENG8、SOGA1、NFIX、SPRY4、NACC1、NECTIN1 和 ATXN2L)具有潜在的结合位点。其中,S100A4作为S100蛋白家族的关键成员,被报道可诱导癌细胞增殖和转移,并参与癌细胞的血管生成和细胞外基质重塑。另外,也有研究表明,S100A4是miR-149-3p的一个靶基因。然而,RUT是否可通过miR-149-3p/S 100A4轴参与乳腺癌进程并不清楚。基于上述研究背景,本研究通过体外细胞实验和体内动物模型共同探讨RUT对乳腺癌细胞及裸鼠移植瘤模型中miR-149-3p和S100A4表达及细胞增殖、血管生成和自噬的影响。旨在探究RUT在乳腺癌进程中的作用及机制,为RUT作为分子靶向药物治疗乳腺癌提供理论依据。第一部分 miR-149-3p和S100A4在乳腺癌病人组织中的表达变化和相关性分析研究目的观察miR-149-3p和S100A4在乳腺癌组织中的表达,分析两者表达与乳腺癌病人预后相关性,并验证两者在乳腺癌中表达的相关性。研究方法根据 Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库,分析 miR-149-3p 和 S100A4 表达水平与乳腺癌患者存活情况的相关性。同时,我们收集2019-2020年在武汉亚心总医院确诊的5对乳腺癌患者癌旁和乳腺癌组织。采用qRT-PCR和免疫印迹技术检测miR-149-3p和S100A4在癌旁,Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期乳腺癌组织中的表达变化。基于miR-149-3p和S100A4在乳腺癌组织中的相对表达,分析两者表达相关性。同时,采用免疫组化实验检测乳腺癌组织中S100A4蛋白的表达。实验结果TCGA数据库显示,miR-149-3p表达高的乳腺癌患者生存期长;而S100A4表达高的乳腺癌患者生存期短。qRT-PCR结果显示,miR-149-3p在乳腺癌组织中低表达,S100A4乳腺癌组织中的高表达。相关性分析结果显示,miR-149-3p和S100A4的表达在乳腺癌组织中呈负相关。免疫组化检测S100A4在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达水平,结果显示S100A4在乳腺癌组织中高表达。结论miR-149-3p在乳腺癌组织中下调,S100A4在乳腺癌组织中上调,且两者表达水平呈负相关。第二部分RUT通过上调miR-149-3p抑制乳腺癌细胞增殖和血管生成,并诱导细胞凋亡和自噬研究目的探究RUT和miR-149-3p对乳腺癌细胞增殖、周期、凋亡、自噬和血管生成相关蛋白表达的影响。研究方法首先,我们采用qRT-PCR检测miR-149-3p和S100A4在人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)和乳腺癌细胞系中的表达。其次,我们用1、5、10、20和40μM的RUT 处理 MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞 0、12、24、48 和 72 h 后,CCK-8 用来检测RUT对MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖活性变化筛选RUT最佳作用浓度和时间。同时,检测RUT对正常乳腺上皮细胞毒性作用。最后,RUT和miR-149-3p inhibitor 共处理 MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞,qRT-PCR 验证 miR-149-3p 的表达变化;CCK-8和克隆形成检测细胞的增殖;