关键词:
土家族医药
血筒
异型南五味子
镇痛抗炎
类风湿关节炎
佐剂性关节炎
分子机制
摘要:
目的:血筒为土家族常用于祛风除湿、行气止痛的药物,经鉴定为五味子科南五味子属植物异型南五味子Kadsura heteroclita(Roxb)Craib的藤茎,民间习用其治疗风湿痹痛、骨痛、风湿关节炎。我们通过建立佐剂性关节炎(AIA)大鼠模型,开展血筒抗类风湿关节炎(RA)药效学及其相关机制研究,从而明确土家族药物血筒临床治疗风湿或关节疾病的药效作用,为其研发为安全有效的民族创新药物奠定基础。方法:1.血筒经95%乙醇提取,浓缩干燥,采用HPLC法对血筒醇提物进行质量控制;ICR小鼠,雌雄各半,随机分为对照组(0.3%CMC-Na溶液)和血筒醇提物组(每3.25 g血筒醇提物溶于10m L 0.3%CMC-Na),24hr内连续给药2次,翌日停药,连续14d观察小鼠饮食、饮水、体质量、精神状态等表现,记录小鼠死亡、毒性反应情况,测定最大耐受量(MTD)。2.采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型和角叉菜胶致大鼠足趾肿胀模型,研究血筒醇提物对急性炎症的抑制作用。ICR小鼠随机分为模型组、吲哚美辛组(10mg·kg-1)、血筒醇提物低、中、高剂量组(200、400、800mg·kg-1),评价血筒醇提物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型的影响;Wistar雌性及雄性大鼠随机分为模型组、吲哚美辛组(10mg·kg-1)、血筒醇提物低、中、高剂量组(剂量设置为200、400、800mg·kg-1及100、200、400mg·kg-1),评价血筒醇提物对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀模型的影响。3.采用醋酸致小鼠扭体实验和光辐射致大鼠甩尾实验考察血筒醇提物的镇痛作用。将实验ICR小鼠随机分为模型组、罗通定组(100mg·kg-1)、血筒醇提物低、中、高剂量组(50、100、200mg·kg-1),观察血筒醇提物对醋酸致小鼠扭体次数的影响;SD大鼠随机分为模型组、罗通定组(100mg·kg-1)、血筒醇提物低、中、高剂量组(50、100、200mg·kg-1),评价血筒醇提物对光辐射致大鼠甩尾潜伏期的影响。4.采用角叉菜胶致大鼠足趾肿胀模型,研究血筒醇提物抗急性炎症作用机制。Wistar大鼠随机分为模型组、吲哚美辛组(100mg·kg-1)、血筒醇提物低、中、高剂量组(100、200、400mg·kg-1)。大鼠后右足足趾皮下注射0.1m L角叉菜胶致炎,5 hr后麻醉大鼠,腹主动脉取血,分离血清,截取双足。测量致炎后1-5h大鼠的足趾容积,用ELISA试剂盒检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的含量,Western Blotting检测大鼠足趾组织中COX-1、COX-2及i NOS蛋白的表达水平。5.建立大鼠AIA模型,初步评价血筒醇提物抗关节炎药效作用。雄性SD大鼠30只,随机分为正常组、模型组、血筒醇提物组。大鼠尾根部免疫注射0.10m L含200μg热灭活结核杆菌(Mtb)的完全弗氏佐剂(CFA)建立AIA模型,血筒醇提物(1.0g·kg-1)口服给药治疗30d。AIA造模后进行后足肿胀测量、关节炎指数评分及体质量称量评价。治疗结束后对后足进行小动物CT扫描和组织病理学检查,用ELISA试剂盒检测血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。6.采用大鼠AIA模型,系统地研究血筒醇提物抗关节炎药效作用及其作用机制。雄性SD大鼠60只,随机分为正常组、模型组、吲哚美辛组(1.0 mg·kg-1)、血筒醇提物低、中、高剂量组(200、400、800mg·kg-1)。大鼠尾根部免疫注射CFA后,于造模当日开始给药,连续给药30d。记录关节炎症状发生的时间,测量大鼠足跖肿胀容积,并按照关节炎严重程度评分法计算关节炎指数,用小动物CT扫描观察后足股破坏程度。第30d末次给药后麻醉大鼠,腹主动脉采血,分离血清,截取双后足,对足组织进行病理学检查。用ELISA试剂盒检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-17A/F含量,Western Blotting检测MMP-1、MMP-3及TIMP-1蛋白的表达水平。结果:1.从210 nm波长条件下的HPLC色谱图观察到血筒醇提物样品中含有Schistandronic acid、D-epigalbacin、Heteroclitalactone A、Schisanlactone E、Nigranoic acid这5个有效成分,含量测定显示Schisanlactone E含量最高,D-epigalbacin的含量最低。2.小鼠对血筒醇提物的最大耐受剂量(MTD)为26g·kg-1(相当于成人一日用量的253倍)。与对照组小鼠相比,给药组小鼠无死亡现象,健康状况良好,体重保持增长趋势,饮食饮水情况正常。3.与模型组相比,血筒醇提物低、中、高剂量组(100、200、400mg·kg-1)能显