关键词:
鼠伤寒沙门菌
鞭毛蛋白
原核表达
巨噬细胞
生物信息学分析
摘要:
【目的】研究鼠伤寒沙门菌FliC蛋白的序列特征、原核表达情况及其对巨噬细胞RAW264.7增殖及细胞因子分泌的影响。【方法】参照GenBank公布的鼠伤寒沙门菌ATCC 14028基因序列设计特异性引物,以鼠伤寒沙门菌ATCC 14028基因组DNA为模板,通过PCR扩增FliC基因CDS序列,应用在线软件分析FliC蛋白结构特征。将FliC基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),将鉴定正确的重组质粒pET-28a-FliC转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建重组菌株BL21(pET-28a-FliC),使用IPTG对重组菌株进行诱导表达并优化重组蛋白的表达条件,对重组蛋白进行镍离子亲和层析纯化,通过SDS-PAGE及Western blotting检测纯化的蛋白。将纯化的重组蛋白与巨噬细胞RAW264.7共同孵育,通过细胞毒性试验检测巨噬细胞增殖情况,采用ELISA法检测巨噬细胞细胞因子分泌情况。【结果】PCR扩增获得大小为1 488 bp的FliC基因,FliC蛋白分子式为C2194H3597N640O641S3,由495个氨基酸组成,分子质量约为52 ku;该蛋白属酸性蛋白,氨基酸残基丙氨酸(12.3%)、苏氨酸(11.5%)出现的频率较高;蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,包含67个磷酸化位点。二级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规则卷曲构成,占比分别为39.80%、20.20%、4.24%和35.76%。SDS-PAGE及Western blotting检测结果显示,重组蛋白部分可溶,与小鼠抗鞭毛血清有较好的反应原性。50和400 ng/mL重组纯化蛋白能有效刺激巨噬细胞的增殖,在24 h增殖率达到最高,同时可有效刺激巨噬细胞分泌细胞因子白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α),在12 h时细胞因子分泌量最高。【结论】本研究成功扩增得到鼠伤寒沙门菌FliC基因,纯化获得的高纯度FliC蛋白为酸性、亲水性蛋白,该蛋白可促进巨噬细胞增殖及分泌细胞因子,为进一步研究沙门菌FliC蛋白的功能奠定基础。