关键词:
针刺镇痛
腺苷
生物传感器
足三里
尾壳核
摘要:
目的:
本研究构建了可在体、实时、动态、连续监测体内腺苷应答变化的新型植入式微型生物传感器研究平台,以注射完全弗氏佐剂(Complete Freund's adjuvant,CFA)诱导的关节炎炎性痛大鼠模型为研究对象,在体检测针刺双侧足三里(ST36)后纹状体尾壳核脑区(Caudate putamen,CPu)腺苷(Adenosine,ADO)的实时变化情况,并通过调控大鼠体内腺苷及腺苷A1受体(Adenosine A1 receptor,A1R)明确调控腺苷信号对针刺镇痛效应的影响。
方法:
实验一植入式微型生物传感器的研制及其电化学测试研究
构建双电极体系的植入式微型生物传感器,其中工作电极为铂丝(直径0.2 mm),参比电极为银/氯化银丝(直径0.1 mm)。将普鲁士蓝(Prussian blue,PB)/氨基化氧化石墨烯(Polyethylenimine-modified graphene oxide,PEI@GO)/腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)、核苷磷酸化酶(nucleoside phosphorylase,NP)、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)和京尼平(Genipin)交联液/邻苯二胺(permselective poly-o-phenylenediamine,P-o PD)和牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)高分子层(PB/PEI@GO/交联酶/O-PD+BSA)采用不同修饰方法修饰到铂电极上,构成植入式微型生物传感器。采用场发射扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscopy,FE-SEM)、循环伏安法(cyclic voltammetric,CV)、计时电位法(coronopotentiometry,CP)、电流-时间曲线(amperometric i-t curve,I-t)等方法对植入式微型生物传感器进行形态表征和灵敏度、稳定性、抗干扰性等电化学检测。
为了验证此植入式微型生物传感器在体检测的可靠性,将制备好的生物传感器植入健康雄性Wistar大鼠的足三里穴区或CPu脑区,在穴区分别注射腺苷或生理盐水和在CPu脑区分别注射不同浓度的腺苷,用I-t监测穴区电流值的变化,观察生物传感器在体内特异性检测外源性腺苷的能力;基于已建立的植入式微型生物传感器研究平台,将制备好的生物传感器植入大鼠足三里穴区和CPu脑区,针刺大鼠足三里,用I-t监测足三里穴区和CPu脑区电流值的变化,观察针刺对足三里穴区和CPu脑区腺苷释放的影响。
实验二基于植入式微型生物传感器技术研究针刺对CFA大鼠中枢腺苷信号影响的实验研究
建立CFA大鼠模型,将健康雄性Wistar大鼠随机分为盐水组、模型组和针刺组。盐水组在右侧足底皮内注射生理盐水(0.1 ml);模型组和针刺组在右侧足底皮内注射完全弗氏佐剂(0.1 ml,1 mg/ml)。在造模24 h后,针刺组大鼠针刺双侧足三里穴,采用平补平泻捻转手法,只捻转不提插,捻转频率为180次/min,行针2 min,每间隔5 min行针1次,共行针4次,共计约30 min,针刺干预1次/日,盐水组和模型组均给予与针刺组一致的固定操作。完成针刺干预后,检测各组大鼠右侧足底热辐射痛阈值和植入式微型生物传感器电流值变化量并进行相关性分析,观察针刺对中枢腺苷信号的影响;使用同样的分组及干预方式干预7天,并检测各组大鼠右侧足底热辐射痛阈值和植入式微型生物传感器电流值变化量并进行相关性分析,进一步观察针刺时程、中枢腺苷释放情况与针刺镇痛效应之间的关系。
实验三调控腺苷信号对针刺镇痛效应的影响研究
实验一和实验二已明确针刺可上调CPu脑区的腺苷含量并产生镇痛效应,为了进一步验证腺苷信号对针刺镇痛效应的影响,本实验在模型组和针刺组的基础上,设置模型+腺苷组,观察腹腔注射腺苷是否可以模拟针刺镇痛效应;设置针刺+茶碱组和针刺+A1R拮抗剂组,观察腹腔注射腺苷非特异性拮抗剂茶碱或A1R拮抗剂是否可以消除针刺镇痛效应;设置模型+PBS组、针刺+盐水组和针刺+DMSO组,观察腹腔注射溶剂是否会影响针刺的镇痛效应。
首先进行药物浓度探索:分别设置高、中、低浓度的茶碱组(15 mg/kg、10 mg/kg、5 mg/kg)、腺苷组(3 mg/kg、1.5 mg/kg、0.8 mg/kg)和A1R拮抗剂组(2 mg/kg、1 mg/kg、0.5 mg/kg),同时设置模型组与针刺组,比较各组大鼠右侧足底热辐射痛阈值,确定最佳药物浓度。
正式实验:将健康雄性Wistar大鼠随机分为模型组、针刺组、模型+PBS组、模型+腺苷组、针刺+盐水组、针刺+茶碱组、针刺+DMSO组、针刺+A1R拮抗剂组,