关键词:
超顺磁性
化学发光
肺疾病标志物
免疫生物传感器技术
摘要:
近半个世纪以来,工业化进程的加速发展导致了严重的全球性环境污染。在这样的大环境下,传染性呼吸道病菌的广泛传播、生活节奏加快导致的身心压迫以及吸烟等不良生活习惯的综合作用,使得人类面临前所未有的肺部疾病困扰。肺结核和肺癌作为人体肺脏的致命病变,严重威胁着超过世界1/3的人口,并引起科学界的关注。肺疾病的早期诊断对于全球性肺疾病的控制和治疗有着显而易见的重要意义,本论文紧随肺结核和肺癌的早期诊断需求,以特异性肺疾病标志物为切入点,开展了2种肺结核早期分泌蛋白和1种肺癌标志性蛋白的低浓度快速定量检测技术研究。\n 本论文首先就肺疾病的研究背景和诊断现状进行介绍和总结,在对现有的蛋白免疫分析技术的充分调研下,设计和建立了用于上述三种蛋白的定量检测方法,即化学发光磁酶免疫分析方法。该方法结合超顺磁性富集技术、酶联免疫吸附分析(ELISA)技术、化学发光放大技术,充分发挥了三者的优势,实现了肺疾病标志蛋白的灵敏、快速、简便检测。本研究工作具体包括以下三个方面:\n 一、肺结核CFP10-ESAT6融合蛋白的免疫检测技术研究\n 采用化学发光磁酶免疫分析技术,结合实验室自制光学检测仪,建立了化学发光磁酶免疫CFP10-ESAT6融合蛋白的快速定量检测方法。在CFP10-ESAT6融合蛋白浓度1~1000ng/mL范围内,检测光强与蛋白浓度在对数坐标下呈线性关系:lg(y)=5.60911+0.27343lg(X),相关性达0.9941检测下限达到1ng/mL,用时45min。检测平均灵敏度达到2463R.L.U/(ng/mL);且一致性良好,变异系数4.47%。与传统的ELISA方法相比,该方泫更适合于实现对CFP10-ESAT6融合蛋白的现场、快速、灵敏的定量检测。\n 二、肺结核早期分泌蛋白CFPlO蛋白的免疫检测技术研究\n 针对较宽浓度范围的CFP10蛋白免疫检测,采用化学发光磁酶免疫分析技术,结合实验室自制光学检测仪,进行检测条件的优化并对0~2000ng/mL CFP10蛋白溶液进行梯度测试。化学发光强度与CFP10浓度在对数坐标下线性方程为lg(y)=3.894+0.671lg(x),线性相关性达到0.962。研究表明,该检测方法对于CFP10抗原的检测具有较好的效果,可以在45min内完成样本的快速、灵敏、特异性的检测。\n 针对低浓度的CFP10蛋白免疫检测,采用带有增强剂的化学发光底物,进行了增强型化学发光磁酶免疫CFP10蛋白定量检测研究。结果发现,增强型化学发光底物不仅使得化学发光光强提高了近2个数量级,而且还将化学发光检测时间缩短到5min,则检测用时为40min。对于0~50ng/mL CFP10蛋白溶液,化学发光强度与反应浓度的线性相关性良好,线性关系为y=38054x+1067290,相关系数达到0.998;且重复性良好,对15ng/mL的CFP10蛋白溶液进行的5min定点测试结果CV为4.86%。研究表明,增强型化学发光磁酶免疫对于低浓度CFP10蛋白的定量分析更灵敏,更快速,更有效。\n 三、肺癌标志物NSE蛋白的免疫检测技术研究\n 基于正常人体的NSE浓度的参考值为5~15ng/mL,建立了增强型化学发光磁酶免疫NSE蛋白定量检测研究。对于O~50ng/mL的低浓度NSE蛋白的检测结果表明,检测灵敏度高,且化学发光强度在200s便达到最大值,检测用时缩短为30min。在0~50ng/mL的NSE蛋白浓度范围内,化学发光强度与反应浓度的线性相关性良好,相关系数达到0.990,线性关系为y=1368090x+13587104,检测下限为0.5ng/mL且一致性较好,对5ng/mL的NSE蛋白溶液进行的200s定点分析结果CV为2.36%。研究表明,增强型化学发光磁酶免疫分析也可实现对低浓度NSE蛋白的定量分析,检测灵敏、快速、特异性高、一致性较好。