关键词:
妊娠期肝内胆汁淤积症
胆汁酸谱
熊去氧胆酸
摘要:
目的1.建立一种全面分析血清胆汁酸谱的超高效液相色谱-高分辨三重四极杆飞行时间质谱(Ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole time-of-flight mass spectroscopy,UPLC-Triple TOF-MS/MS)方法,实现血清游离型及甘氨酸、牛磺酸、葡萄糖醛酸和硫酸结合型胆汁酸的同时检测。2.用所建方法测定健康孕妇、妊娠期肝内胆汁淤积症(Intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)患者和熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)治疗ICP患者的胆汁酸谱,揭示其胆汁酸谱的代谢特征,探讨ICP患者体内胆汁酸代谢改变及UDCA治疗对胆汁酸代谢影响。方法1.血清样本经固相萃取前处理后,采用UPLC-Triple TOF-MS/MS检测。待测物经Kinetex C18柱分离,流动相为15 mmol/L乙酸铵和乙腈,采用梯度洗脱。在电喷雾电离、负离子模式下,通过全扫描与子离子扫描,获取胆汁酸的一级与二级质谱数据,结合拟靶向分析策略,对胆汁酸进行定性和定量分析。2.用所建立的方法对ICP组、UDCA治疗组及对照组孕妇的胆汁酸谱进行全面分析,揭示其胆汁酸代谢特征,阐明ICP患者体内存在的胆汁酸代谢改变及UDCA治疗对胆汁酸代谢影响。3.采用正交偏最小二乘判别分析结合受试者工作特征曲线分析,筛选ICP的诊断标志物。4.将UDCA组孕妇分为不良结局组与无不良结局组孕妇,探索不良结局与胆汁酸之间的关系。采用相关性分析,探索胆汁酸与肝功能指标及胎儿不良结局之间的相关性。结果1.建立的UPLC-Triple TOF-MS/MS方法,可实现45种胆汁酸的准确定量,包括10种游离胆汁酸(Free bile acids,free-BAs)以及7种甘氨结合型胆汁酸(Glycine-conjugated bile acids,G-BAs)、10种牛磺结合型胆汁酸(Taurine-conjugated bile acids,T-BAs)、13种硫酸化胆汁酸(Sulfate-conjugated bile acids,BAs-S)和5种葡萄糖醛酸结合型胆汁酸(Glucuronide-conjugated bile acids,BAs-G),同时识别并鉴定了人体血清中26种可能的胆汁酸,获得全面、准确的血清胆汁酸代谢信息。2.分段绘制标准曲线,胆汁酸在各范围内均呈现良好线性关系(R2≥0.9900)。胆汁酸日内精密度≤17.39%,日间精密度≤18.18%。胆汁酸回收率均在76.9%-124.4%之间。3.健康孕妇BAs-S、BAs-G在血清胆汁酸的占比分别为26%,6%。与对照组相比,ICP组孕妇血清中33种胆汁酸显著升高,主要为结合型胆汁酸。G-BAs、T-BAs成为血清胆汁酸的主要组成部分,分别占48%和39%。UDCA组孕妇,胆汁酸池发生亲水性转变,UDCA及其结合形式成为胆汁酸池的主要组成部分,特别是GUDCA-3-S。4.筛选出TCDCA、GCDCA为ICP的潜在诊断标志物,且发生胎儿不良结局的ICP患者较没有发生不良结局的ICP患者血清TCDCA、GCDCA显著升高。5.血清GCDCA-3-S、TCDCA-3-S、GCA-3-S、GDCA-3-G与转氨酶、胆红素等肝功能指标呈正相关。结论1.建立的UPLC-Triple TOF-MS/MS方法,可同时检测血清游离型及甘氨酸、牛磺酸、葡萄糖醛酸和硫酸结合型胆汁酸,可实现45种胆汁酸的准确定量,同时识别并鉴定了人体血清中26种可能的胆汁酸。***-S、BAs-G是人体血清胆汁酸池的重要组成部分,分别占胆汁酸的26%和6%。ICP孕妇血清胆汁酸主要由T-BAs与G-BAs组成,提示机体主要通过生成T-BAs与G-BAs进行代偿,而非BAs-S、BAs-G。UDCA治疗可影响胆汁酸代谢,主要表现为UDCA及其结合形式显著升高,体内胆汁酸发生亲水性转变。3.筛选出的ICP诊断标志物GCDCA、TCDCA与胎儿不良结局也密切相关,其可能在ICP发病及致病中发挥重要作用。