关键词:
HDAC6抑制剂
高效液相色谱法
药代动力学
阿尔茨海默病
摘要:
[目的]阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是最常见的痴呆形式,其发病机制归因于脑皮质和边缘区域中淀粉样蛋白β(Amyloid β-protein,Aβ)斑块的细胞外聚集和由过度磷酸化Tau(Tubulin-associatedunit)蛋白形成的细胞内神经原纤维缠结。随着老龄化加剧,预计2050年全球每85人将有1人罹患AD,这会造成医疗负担日益加重。尽管近三年来已有三款获批上市的阿尔茨海默病创新药(Lecanemab,Aducanumab和GV-971),但它们只能暂时缓解疾病症状,目前没有一种药物被证明能够治愈或阻止AD的进展。因此,需要继续寻找驱动疾病进展的新机制和药物靶点以及研发创新药物。W5(C19H16ClN3O2S)是一种新合成的具有高选择性的HDAC6抑制剂,前期体外研究显示W5可以抑制Aβ聚集、促神经生长、靶向金属内稳态失衡等,可能具有多靶向抗AD的作用。为了进一步研究W5在动物体内的吸收、分布、代谢情况,本课题拟建立一种快速高效的检测生物样品中W5含量的高效液相色谱法(High-performance liquid chromatography,HPLC)。依据此法在大鼠体内进行W5药代动力学(Pharmacokinetics,PK)初步研究,以得到相关PK参数和药物血脑屏障通透性的分析结果,为其应用于临床研究提供可靠的依据。此外,对大鼠长期服用W5的安全性进行了初步研究,为进一步验证药物效应动力学奠定基础。[方法]1.W5生物样品分析方法的建立使用紫外可见分光光度计,以甲醇为参比溶液在200 nm至1100 nm进行全波长扫描,确定W5的检测波长。通过摸索色谱柱、流动相的种类及比例、流速等条件,确定W5的色谱分析条件。探索不同提取剂和复溶溶剂在空白脑组织和血浆中的提取回收率,确定提取效果良好且特异性好的前处理方法。最后通过特异性、线性、定量下限、最低定量限、检出限、精密度、准确度、提取回收率和稳定性等参数对所建立的方法进行验证。2.W5在大鼠体内的药代动力学初步研究灌胃给予大鼠 W5 溶液 100mg/kg,在给药后 5、15、30、45、60、120、180、240、360 min分别进行脑组织分离和腹主动脉取血,每个时间点均有3只大鼠作为平行样。根据确定好的生物样品前处理方法,处理27只大鼠的脑组织和血浆样品,用0.22 μm微孔有机滤膜过滤后注入HPLC系统进行分析。根据所得的药物浓度和时间的数据,绘制药物-浓度时间曲线,使用DAS 2.0药代动力学分析软件采用非房室模型和统计矩法计算主要PK参数。3.W5在大鼠体内的安全性研究将30只SD大鼠随机分为3组:对照组,W5低剂量组,W5高剂量组。适应性喂养一周后,给药组分别给予化合物W5 15 mg/(kg·bw)/day和30mg/(kg·bw)/day,对照组灌胃给予同剂量W5溶剂,持续8周。在整个研究期间,每天观察大鼠临床体征(毛发、瞳孔、行为、姿势等),每周记录一次大鼠体重。用药周期结束后,记录大鼠最终体重并将其处死,收集脑、肝脏、肾脏等样品,计算相对器官重量。采集血液,经处理后得到的血清用于生化血清分析及氧化应激指标的测试。大鼠血清中白蛋白(Albumin,ALB)、尿素氮(Ureanitrogen,BUN)、肌酐(Creatinine,CREA)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartateaminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、丙氨酸氨基转移酶(Alanine amino-transferase,ALT)等肝功能、肾功能相关指标使用全自动生化分析仪按照仪器分析程序进行测定。根据预试验结果,选取不同浓度血清,使用酶标检测仪测定超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)分型、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase,GSH-Px)活力,以及谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量。[结果]1.W5生物样品分析方法的建立及方法学考察确定检测W5的色谱条件为:高效液相色谱仪;检测器:二极管阵列检测器;检测波长:251 nm;色谱柱:SHIMADZUC18(250mm×4.6mm,5 μm);流动相:有机相(甲醇/乙腈=1/1):水相(0.05%H3PO4+1.5%THF)=70:30;流速:1 mL/min;柱温:40℃;进样量:10 μL;样品采集时间为24 min。确定生物样品前处理方法为:取0.1 g脑组织样品,按体积比1:5加入乙腈提取剂,用均质仪匀浆(7m/s,每次15 s,3个循环),然后以10000 rpm的