关键词：
血浆肾素活性
血管紧张素Ⅰ
前处理优化
高效液相色谱-质谱联用
摘要：
目的:本论文结合内标校正、酶抑制剂、有机试剂沉淀蛋白的前处理方法以及高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析检测技术手段,建立一个简单快速、特异性好、灵敏度高、重复性好及准确度高的检测肾素的方法,并将其应用于健康人和高血压患者的相关疾病研究中,比对和传统方法检测结果的一致性。方法:首先采用质谱针泵直接进样,用标准品对目标检测物进行质谱的条件和参数的优化,然后再进行液相条件的参数优化,获得本实验需要的LC-MS/MS测量条件。在适宜的条件下孵育血浆,使肾素酶具有活性,促进反应的发生,并且阻止在反应过程中生成的AngⅠ（血管紧张素Ⅰ）发生降解,最后在一定的时间内终止反应,通过测量反应生成AngⅠ的含量,结合孵育时间计算血浆肾素活性。实验对血清样品的前处理步骤进行逐步优化。具体包括:仪器线性范围、牛血清白蛋白的干扰性、去蛋白沉淀剂的选择以及体积的选择、酶抑制剂浓度和体积的选择和孵育时间的选择等。实验采用正离子电喷雾电离模式,用标准品确定标准曲线并且结合同位素内标法进行精确定量,建立测定血浆中Ang I的LC-MS/MS方法。最后考察所建立方法的线性范围、检测限、定量检测限、日间和日内精密度、日间和日内加标回收率以及样品稳定性。结果:实验通过质谱针泵直接进样和LC-MS/MS方法对Ang I以及内标进行检测,得到优化好的MRM参数,其中包括分析物的母离子和子离子的离子对信息、DP、EP、CEP、CE和CXP值等。在使用标准品进行液相条件的优化中,得到的液相优化结果包括:C18反相色谱柱（5μm,4.6×150 mm）,有机相A为含0.1%甲酸的甲醇,水相B为含0.1%甲酸的水。对肾素作用生成Ang I反应过程的前处理条件进行优化,选择牛血清白蛋白作为空白血浆,选择乙腈作为去蛋白试剂,复溶的溶剂选择甲醇-水（1:1,V/V,0.05%FA）,选择PMSF（苯甲基磺酰氟）作为终止反应的抑制剂,反应的孵育时间为3 h。在本实验各种优化条件下,通过采用LC-MS/MS技术,再结合孵育时间计算血浆肾素活性（PRA）。整个LC-MS/MS技术方法检测时间为15 min。仪器的线性范围和方法的线性范围均为0.5-100 ng·m L-1,检测限为0.2 ng·m L-1,定量检测限为0.5 ng·m L-1。在低、中、高浓度中的批内精密度分别为7.29%-10.72%、3.76%-8.94%、3.93%-5.99%。各浓度连续三天的批间精密度为6.71%、1.36%、1.23%。在低、中、高浓度中的加标回收率分别为70.79%-101.28%、75.68%-110.45%、65.27%-81.37%。各浓度加标回收率的相对标准偏差分别为13.91%、13.77%、8.84%。最后,利用本研究建立的方法与同一临床样本结果作对比时,表现出较好的一致性趋势。结论:本研究建立了通过测量反应生成的Ang I的含量,结合孵育时间计算PRA的方法,此方法结合蛋白沉淀、前处理优化、酶抑制和LC-MS/MS技术。结果表明,该方法前处理步骤简单方便、孵育条件适宜,孵育后显著提高了质谱仪的检测灵敏度。而且,该方法具有较好的方法重复性、批间精密度和批内精密度较好,以及低、中、高浓度的加标回收率良好。本实验采用内标校正法进行精确定量,并且将该方法应用于健康人、高血压患者的血浆肾素活性的分析检测中,检测结果与传统方法检测结果具有一致性。
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