关键词:
感染性疾病
宏基因组纳米孔测序
病原体鉴定
抗生素耐药性
摘要:
背景感染性疾病仍然是全球所有患者发病和死亡的主要原因。早期识别病原体及其抗生素耐药性对于感染性疾病患者的管理和治疗至关重要。然而,传统的病原体鉴定方法存在耗时长、灵敏度低、检测范围窄等不足,延迟或错误的病原体鉴定极大地影响了最终的抗微生物治疗。宏基因组纳米孔测序通过对样本中所有核酸进行测序有潜力检测到所有病原体,并且该方法还能实时对长读数进行分析从而实现快速准确鉴定病原体的目的。然而,基于纳米孔的宏基因组测序(m NGS)在病原体检测中的应用仍然存在许多挑战,比如无差别获取DNA难,病原体鉴定标准不一。目的本研究旨在感染性疾病样本中优化DNA提取方法并比较测序指标的病原体鉴定能力,建立检测病原体的m NGS方法,进一步评估该方法的灵敏度、特异度和诊断速度。方法论文第一部分:对20份尿路感染患者的尿液样本采用机械破碎法、酶促裂解法和对照法提取DNA,并进行下游纳米孔测序。在提取DNA的产量和完整性、特定物种鉴定和微生物群落多样性方面对三种不同DNA提取方法进行评估,以选取最适合纳米孔测序的DNA提取方法。论文第二部分:对63份疑似呼吸机相关性肺炎(VAP)患者的气管内抽吸物(ETA)样本进行基于纳米孔的m NGS测序。建立受试者工作特征(ROC)曲线,比较目标病原体读数、微生物读数百分比和相对丰度的病原体鉴定能力,选取诊断价值最高的m NGS指标,根据其最佳约登指数确定阈值标准。接着分别与微生物培养和综合标准比较以评估该方法的准确性。然后采用χ2检验对m NGS和微生物培养的病原体检出种类进行比较。最后用m NGS对耐药基因进行分析。结果论文第一部分:对于DNA产量,机械破碎法提取的DNA浓度(1.1ng/μL,IQR:0.2-8.2ng/μL)显著低于对照法(4.0ng/μL,IQR:1.1-14.9ng/μL)(P<0.0001),而酶促裂解法(2.9ng/μL,IQR:0.9-23.3ng/μL)与对照法无显著差异(P>0.05)。对于DNA完整性,酶促裂解法获得的微生物读数的平均长度(1045.7bp,IQR:521.3-1488.3bp)明显长于对照法(564.6bp,IQR:246.0-805.3bp)(P<0.0001)和机械破碎法(515.8bp,IQR:338.9-1001.7bp)(P<0.01)。在所有20份样本中,对照法鉴定出15份(75%)样本中由培养确认的病原体,机械破碎法鉴定出14份(70%),酶促裂解法将其全部鉴定成功(100%)。对于微生物群落多样性,与对照法和机械破碎法相比,酶促裂解法获得的微生物种类更多,Shannon指数也更高。论文第二部分:ROC曲线表明相对丰度的诊断价值最高(曲线下面积=0.847),鉴定病原体的相应阈值为9.93%。与微生物培养相比,m NGS的灵敏度、特异度和准确度分别为91.3%、78.3%和86.5%;而与综合标准相比,m NGS的灵敏度、特异度和准确度分别为97.4%、100%和98.1%。m NGS对混合感染的检出率(47.6%)显著高于微生物培养(27.0%)(P=0.017)。m NGS检测到的耐药基因与耐药表型一致率较高。与早发型VAP患者相比,晚发型VAP患者呼吸道微生物组中耐药基因的比例明显更高(P=0.041)。m NGS的中位周转时间为4.43h,而常规微生物培养为72.00h。结论本研究表明酶促裂解法与基于纳米孔的m NGS分析的匹配度最高,更利于准确可靠的识别病原体。在VAP中,m NGS的病原体检测准确度高且周转时间短,表明本研究建立的方法可以在接收ETA样本后5h内准确鉴定VAP相关病原体并进行耐药性预测。